降解黃曲霉毒素微生物篩選中降解與吸附結合作用的區分*

李超波，李文明，楊文華，楊小龍，曹郁生

(食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學中德聯合研究院，江西南昌，330047)

降解黃曲霉毒素微生物篩選中降解與吸附結合作用的區分*

李超波，李文明，楊文華，楊小龍，曹郁生

(食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學中德聯合研究院，江西南昌，330047)

黃曲霉毒素的污染不僅帶來巨大的經濟損失，而且嚴重危害人和動物的健康，因而生物降解真菌毒素一直引人關注。但在研究黃曲霉毒素微生物降解時，首先必須要有可靠的方法來判定毒素是被降解還是可逆的吸附結合。該文在黃曲霉毒素B1(AFB1)降解菌株篩選中，對區分降解與吸附結合作用的方法進行了研究，建立了可靠的分析方法，通過比較不同pH的影響，細胞滅活對AFB1去除的影響，分析菌株細胞水洗脫、有機溶劑萃取后AFB1的變化等方法，有效地排除了生物吸附結合以及pH的干擾，區分了降解作用和可逆的吸附作用，這些方法簡單實用。據此，從動物糞便中成功篩選到了2株能高效降解AFB1的菌株F4、F7。

黃曲霉毒素B1，微生物降解，吸附結合，區分

黃曲霉毒素(aflatoxin)是黃曲霉等真菌產生的具有強毒、致癌的次級代謝產物[1］，其中以 B1的毒性最強，因而世界衛生組織把黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)定為 ΙA 類致癌物質[2］。黃曲霉毒素母體的基本結構為二呋喃環和香豆素，其中AFB1是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有1個雙呋喃環和1個氧雜萘鄰酮(香豆素)。前者與毒性和致癌性有關，后者增強前者的毒性和致癌性。

AFB1清除去毒的方法主要包括化學法、物理法和生物法。但是化學法、物理法會對食品的質量和營養有不同程度的影響，甚至引起污染。因此利用生物學方法，尤其微生物降解真菌毒素受到密切關注。

微生物對真菌毒素有2種作用方式，一是降解轉化，二是吸附結合。前者是將毒素分解轉化生成新的產物，后者則是一個可逆的過程。因而區分降解作用和吸附結合是研究微生物降解毒素的一個重要的基礎工作。已經發現有多種微生物對AFB1有結合吸附能力，其中對酵母、乳酸菌的研究較多[3-7］。酵母和乳酸菌可以在細胞壁和特殊的結合位點上結合不同的分子，如大分子物質、金屬離子等[6，8］。研究證實，這些微生物主要是通過細胞壁吸附毒素，死亡細胞仍具有結合能力。有研究指出，酵母細胞壁的甘露聚糖在對AFB1的吸附中起著重要作用。和酵母不同，乳酸菌對 AFB1的結合能力有高度的種特異性[9］，主要與細胞壁上的肽聚糖組分有關。這種結合是可逆的，反復洗脫或加入有機溶劑都能使毒素游離出來。

目前對微生物吸附結合AFB1的研究較多，而降解方面的報道很少[10-12］。AFB1的生物降解，是指AFB1分子的毒性基團被微生物產生的次級代謝產物或者酶分解破壞，同時產生低毒或者無毒的降解產物的過程，毒素生物降解是一種化學反應的過程，完全不同于吸附結合作用[13］。1966年Ciegler等報道了Flavobacterium aurantiacum B-184具有降解AFB1的作用[12］。但后來有人認為并非真正的降解，而是微生物將氯仿溶性的AFB1轉化為水溶性的毒素[14］。Hormisch等[15］從煤田附近污染的土壤樣品中分離到1株能夠降解AFB1的分枝桿菌，進一步試驗證明其對AFB1的降解是生物酶解作用。國內有人研究了枯草桿菌、乳酸菌、醋酸菌、面包酵母、釀酒酵母、米曲霉等對AFB1的降解作用，認為枯草桿菌、乳酸菌和醋酸菌的作用最強[16］，但因沒有排除細胞結合的作用，是否對毒素有降解作用尚不能肯定。另外，外界pH的變化尤其堿性環境也會引起AFB1的降解。因而在篩選降解AFB1的微生物或者確定毒素是否降解時，必須利用可靠的方法來排除吸附結合或者酸堿度變化引起的假陽性結果，而不能單純根據試驗樣品中毒素量的變化做出判斷。

本研究在AFB1降解菌株篩選中，采用了幾種可行的方法排除微生物的吸附作用以及pH的干擾，有效區分了降解作用和吸附作用，并應用于目標菌株的篩選，得到了較好的結果。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，3K18型Sigma高速冷凍離心機(德國，Sigma公司)，PB-10型精密pH計(Sartorius公司)。

AFB1標準品(以色列，Fermentek公司)，Milli-Q超純水，甲醇、乙腈(色譜純，天津永大化學試劑)，PVDF 濾膜(0.45 μm 孔徑)。

1.2 菌株和培養基

菌株:從動物糞便樣品中分離出2株具有去除AFB1能力的革蘭氏陰性菌株，編號為F4和F7。

培養基:種子培養基為營養肉湯(pH7.0);發酵培養基(g/L):3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，8.5 g NaCl，1 g葡萄糖，1 g KH2PO4，pH 6.5，121 ℃滅菌 20 min;菌種保存，營養瓊脂斜面傳代。

1.3 AFB1的檢測與分析

對Teniola等[17］所描述的方法稍加修改:培養結束后，反應混合液用等體積的二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷層室溫下氮氣緩和揮干，用0.5 mL流動相溶解殘余物(濃縮1倍)，過膜處理，混勻進樣。進樣量20 μL。色譜條件如下:

色譜柱:CAPCELL PAK UG120 RP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm);流動相:V(水)∶V(乙腈)∶V(甲醇)=6∶3∶1;柱溫:30 ℃;流速:1 mL/min;紫外檢測波長:362 nm。

AFB1的去除率計算:

1.4 AFB1降解與吸附結合作用的區分

1.4.1 菌液對AFB1的去除

取斜面保藏菌種F4、F7分別接種于5 mL種子培養基中，37℃，150 r/min振蕩培養24 h，再以5%的接種量轉接于100 mL發酵培養基中，37℃，150 r/min振蕩培養48 h，分別取975 μL菌體發酵液與25 μL AFB1標準品(100 μg/mL)置于滅菌的1.5 mL離心管中，使其毒素終濃度為2.5 μg/mL，以無菌的發酵培養基加AFB1作為空白對照，37℃，150 r/min暗處振蕩培養72 h，3次平行。反應結束后，通過離心(6000 r/min，室溫，10 min)去除菌體，取其上清液測樣。

1.4.2 細胞和上清液及熱處理對AFB1的去除作用

試驗分為4組:(1)細胞懸液。將培養好的F4與F7菌液離心(6000 r/min，4℃，10 min)得到菌體細胞，用PBS溶液(10 mmol/L，pH 7.0)充分洗滌2次，然后重懸于PBS(10 mmol/L，pH7.0)中，使溶液中的細胞數分別為1×109CFU/mL和5×109CFU/mL。(2)上清液。(3)細胞懸液和上清液熱處理組。取細胞懸液和上清液分別置于100℃水浴中，10 min，進行熱處理。

分別取 25 μL AFB1標準品(100 μg/mL)添加到975 μL上述處理的4種液體中，使其毒素終濃度為2.5 μg/mL，以 PBS(10 mmol/L，pH 7.0)代替細胞懸液及上清液作為對照，37℃，150 r/min暗處振蕩培養72h，3次平行。反應結束后，菌體細胞通過離心去除(6000 r/min，室溫，10 min)。

1.4.3 毒素洗脫萃取試驗

以PBS液和含2.5 μg/mL AFB1的PBS作為對照，將與毒素作用后的細胞分散于1.0 mL PBS(10 mmol/L，pH 7.0)中，37 ℃保溫 10 min，離心，重復處理3次，用HPLC分析每次被洗脫下來的AFB1。同時以二氯甲烷萃取后的含2.5 μg/mL AFB1的PBS作為對照，將與毒素作用后的細胞用1.0 mL二氯甲烷萃取3次，除去二氯甲烷層室溫下氮氣緩和揮干，用0.5 mL流動相溶解殘余物(濃縮1倍)，過膜處理，利用HPLC檢測萃取到的AFB1。根據結果計算洗脫率，分析其降解和吸附結合作用。

1.5 pH值的影響和排除

pH變化對黃曲霉毒素降解有著很大影響，而所用的2株菌在培養中會引起pH值上升，為了控制培養過程中pH變化的影響，對發酵培養基進行了改良，使之在培養過程中能維持pH的穩定，以排除干擾。以空白 PB緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)以及Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 依次為 7.5，8.0，8.5，9.0)與AFB1作用作為對照(作用條件與1.4.1相同)。

1.6 數據分析

本研究采用SPSS18.0統計軟件進行分析。試驗結果數據用均數±標準差(±s)表示，不同組之間的差異性采用one-way ANOVA方法進行比較，P＜0.05表示差異顯著具有統計學意義。

2 結果和討論

對分離的具有降解AFB1活性的2株細菌F4和F7進行了考察，以確定其對毒素是否有真正的降解作用。

2.1 AFB1降解與吸附結合作用的區分

2.1.1 細菌培養液中AFB1的去除

F4和F7菌株48 h的培養液中添加2.5 μg/mL AFB1，37 ℃，150 r/min 振蕩培養 72 h，取樣檢測分析，結果表明，兩株菌對AFB1的去除率分別達到90.03%和84.56%，見表1。可見2菌具有良好高效的去毒活性。接著做進一步的試驗，以排除吸附結合或者環境條件的作用。

表1 菌株F4與F7對AFB1的去除效果

2.1.2 細胞和上清液及熱處理對AFB1的去除作用

由圖1可以看出，上清液對AFB1去除率很低，分別只有10.75%和6.92%。與上清液相比，菌細胞更能有效地去除AFB1，分別為82.84%和79.07%，接近于細菌培養液。F4與F7的細胞或上清液在100℃處理10 min后會幾乎失去去毒活性。

圖1 菌株F4、F7對AFB1的去除作用

從菌細胞與上清液對AFB1去除效果可以看出，F4與F7去毒主要是細胞的作用，而上清液作用甚微，一種原因可能是AFB1被胞內活性物質降解，另一個原因是毒素被細胞吸附結合。上清液對毒素也有少量的去除作用，這可能是培養過程中有少量細胞死亡自溶，胞內的活性物質逸出引起AFB1的去除。

熱處理可導致細胞去毒活性幾乎消失，這可能是胞內活性物質酶的失活引起的。為了排除吸附結合作用，采用水洗脫和溶劑萃取方法做進一步分析。

2.1.3 毒素洗脫萃取

對實驗中與AFB1反應的F4和F7細胞進行洗脫試驗，PBS重復洗脫3次，取樣用HPLC分析，均未檢測到AFB1。由圖2可以看出，用有機溶劑二氯甲烷對活細胞進行萃取，分析發現分別只有3.17%和3.91%的AFB1被洗脫下來，而對照組中可萃取到80.60%的AFB1。

圖2 二氯甲烷對去毒細胞上AFB1的萃取率

Peltonen等[6］提出乳酸菌吸附結合去除 AFB1，與細胞壁形成微弱的非共價結合及疏水作用相關，是一個可逆的過程，經過反復水洗或者有機溶劑萃取，毒素可以重新釋放出來。Haskard等[7］發現，吸附結合AFB1的鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus LC-705)，反復水洗，可以釋放出38%的毒素;而用三氯甲烷萃取，可以釋放出 98%的 AFB1。Lillehoj等[18］對具有生物降解AFB1活性的橙色黃桿菌NRRL B-184的活細胞用水反復洗脫以及三氯甲烷萃取，均未檢測到有AFB1。發現對反應后的F4、F7活細胞，經反復水洗或者二氯甲烷萃取，都幾乎檢測不到AFB1，因而可以排除細胞的吸附結合作用，而是一個毒素被降解的反應過程。這與前人報道的結論相符。

2.2 pH的影響和排除

由于堿性環境中黃曲霉毒素會被分解，因而在考察降解活性時必須注意pH變化對毒素的影響。從圖3可以看出，pH 7.0時AFB1幾乎無損失;pH 8.5時有30.43%的AFB1被分解;pH 9.0時有58.96%的AFB1被分解，pH更高時可能導致更多的AFB1分解。這可能是在堿性環境下，AFB1的內酯鍵易受親核試劑，尤其是OH-的攻擊，從而引起內酯環的打開造成化學降解。因而必須注意反應液中pH的變化，否則會影響結果判定的準確性。

實驗中發現，分離到的活性菌株F4和F7在培養后會明顯引起培養液pH上升，24 h后達到8.1(見圖4)，如不加以控制，就會影響結果的準確性。因此對培養基通過添加0.1%的KH2PO4進行改良，初始pH值調為6.5，從圖4還可以看出，改良之后F4、F7菌株在培養中的pH得到了有效控制，一般維持在了7.0左右，從而有效地排除了pH的干擾。

圖3 pH對AFB1化學降解的影響

圖4 發酵培養基改良前后培養物pH值的變化對比

在以上試驗中，首先區分了菌細胞、上清液的去毒活性，證實菌細胞展現了主要活性。然后通過熱處理，以了解加熱滅活后去毒活性的變化，發現滅活細胞失去了活性。進而再利用洗滌萃取方法作進一步證實，通過這些排除了細胞的吸附結合作用，確定了F4和F7菌株是真正有降解活性的細菌。細菌對AFB1的吸附結合主要是與細胞壁或者細胞壁主要成分如多糖、肽聚糖等物質對AFB1的作用相關，而生物降解去毒是指通過酶促降解或轉化AFB1形成無毒或者低毒產物的過程[19］，是一種化學反應過程，完全不同于吸附結合作用。EL-Nezami等[20］指出，有吸附結合AFB1能力的鼠李糖乳桿菌，其熱處理死細胞具有與活細胞同樣的吸附能力。而F4和F7菌細胞熱滅活后，基本沒有去毒作用，從而排除了細胞吸附結合AFB1的可能性。這提示是細胞產生的酶或其他代謝產物對AFB1的降解作用。在此基礎上，對該菌株的降解活性，相關的酶或其他活性物質，以及代謝產物正在做更深入的研究。

3 結論

本文在AFB1降解菌株篩選中，對區分降解作用與吸附結合的方法進行了研究。通過比較不同pH的影響，細胞滅活對AFB1去除的影響，分析菌株細胞水洗脫、有機溶劑萃取后AFB1的變化等方法，有效地排除了生物吸附結合以及pH的干擾，區分了降解作用和可逆的吸附作用。將這些方法應用于目標菌株的篩選，從樣品中成功篩選到了2株具有高效降解AFB1活性的菌株F4和F7。

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ABSTRACTAflatoxin contamination not only leads to serious economic losses，but also is detrimental to human and animal health.Much attention has been paid to mycotoxins biodegradation in recent years.For investigation of microbial detoxification，however，a reliable method is needed to decide whether the toxin is degraded or reversibly bound.In this paper，several methods were tested to differentiate the degrading AFB1from adsorbing during the screening of aflatoxin B1-degrading microbes.Through comparing the AFB1detoxification differences between living cells and dead cells，analyzing the residual AFB1from microbial cells by aqueous washing and organic solvent extracting，and maintaining a stable pH of medium，we have effectively excluded the biological adsorbing and binding and pH interferences，and distinguished the degradation from the reversible adsorbing.It has been demonstrated that F4 and F7 strains have high AFB1degradation activity.

Key wordsaflatoxin B1，biodegradation，adsorb and bind，distinguish

Distinguishing Degradation from Binding of AFB1in Screening of Aflatoxin-degrading Microorganisms

Li Chao-bo，Li Wen-ming，Yang Wen-hua，Yang Xiao-long，Cao Yu-sheng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者，E-mail:yyssccc@hotmail.com)。

*國家自然科學基金項目(31060022)

2011-12-28，改回日期:2012-03-21