“酒精沼氣雙發酵耦聯工藝”中硫化物對酒精發酵的影響*

劉慧慧，姜立，張成明，張建華，毛忠貴

1(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

“酒精沼氣雙發酵耦聯工藝”中硫化物對酒精發酵的影響*

劉慧慧1，2，姜立1，2，張成明1，2，張建華1，2，毛忠貴1，2

1(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

“酒精沼氣雙發酵耦聯工藝”中硫化物會對酒精發酵產生抑制，不利于工藝的穩定運行。與對照相比，pH 4.0，24 mmol/L的硫化物使酒精發酵時間從48 h延長至318 h，酒精產量由90.73 g/L下降至82.28 g/L，酵母數量由3.78×108/mL下降至2.20×108/mL，甘油產量由6.99 g/L上升至11.02 g/L。甘油產量上升是硫化物存在時酒精產量下降的原因之一。硫化物對酒精發酵的抑制性隨添加時間的推遲而減弱，這是因為在酒精發酵過程中，硫化物會以H2S的形式隨著CO2一起從發酵液逸出。pH 4.0時，硫化物對酒精發酵的臨界抑制濃度為1.2 mmol/L。

木薯，燃料酒精，硫酸根，硫化物，臨界抑制濃度

木薯是世界上最大的能源作物之一，正逐漸成為我國非糧燃料酒精生產的主要原料。蒸餾廢液治理問題已成為木薯燃料酒精進一步發展的“瓶頸”問題，亟需解決。利用傳統的“厭氧好氧”生物技術處理蒸餾廢液具有投資大、運行費用高，以及處理不徹底等缺點，因此很多學者對酒精蒸餾廢液回用工藝進行了研究[1-4］。通常情況下，蒸餾廢液的回用比不能超過30%，否則會造成酒精產量的下降[5］。

為了解決蒸餾廢液污染問題，根據清潔生產理論并結合本研究室在酒精生產方面積累的經驗，提出了木薯燃料酒精的“酒精沼氣雙發酵耦聯”工藝(圖1)。在該工藝中，采用高溫-中溫兩級串聯厭氧沼氣發酵系統來處理蒸餾廢液，中溫厭氧出水作為下一批次酒精發酵的配料水進行回用，從而解決了蒸餾廢液的污染問題，實現了木薯燃料酒精生產的無廢(水)制造。在“酒精沼氣雙發酵耦聯”工藝中，擯除了運行成本高的好氧生物處理工藝，降低了污水治理成本;對厭氧出水進行回用還可以節約大量寶貴的水資源，因而具有良好的經濟效益和社會效益[6-8］。

在“酒精沼氣雙發酵耦聯”工藝中，中溫厭氧出水(pH 7.8～8.2)被用作配料水，配料結束后，料液pH通常在7.0以上，偏離了液化酶作用的最佳pH范圍(6.0～6.4)。為了保證良好的液化效果就必須對料液加酸進行調節。厭氧出水強大的緩沖能力(堿度通常在3000～4000 mg/L CaCO3)大大增加了料液pH調節時的硫酸使用量。SO42-在酒精發酵過程中處于“惰性”狀態，不會對酵母生長和酒精發酵產生影響。而蒸餾廢液中的SO42-會在沼氣發酵過程中被還原為硫化物[(方程(1)～(3))］，而硫化物對酒精發酵具有潛在的危害。

圖1 木薯“酒精沼氣雙發酵耦聯工藝”流程圖

在厭氧出水中(pH 7.8～8.2)，硫化物主要以S2-和HS-的形式存在[9］。但在酒精發酵條件下(pH 4.0～5.0)，硫化物主要以H2S形式存在。當電中性的H2S分子進入細胞內時，會破壞細胞的蛋白質，進而抑制微生物的生長;H2S還可以通過形成硫鏈來干擾代謝輔酶A和輔酶M，進而影響微生物的生長和代謝。在傳統酒精生產中，硫化物不會對酒精發酵產生抑制，因此，未見相關報道。本文的目的在于通過實驗確認硫化物對酒精發酵產生抑制的臨界濃度，為“酒精沼氣雙發酵耦聯”工藝中配料水(厭氧出水)的水質控制提供數據支撐;同時對硫化物抑制酒精發酵的機理做初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯

河南天冠集團有限公司提供。

1.1.2 菌種

Saccharomyces cerevisiae，安琪酵母股份有限公司生產。

1.1.3 主要試劑和藥品

液體耐高溫α-淀粉酶(20000 U/mL)、液體糖化酶(130000 U/mL)，無錫杰能科生物工程有限公司產品。其它試劑均為分析純或優級純市售商品。

1.1.4 種子培養基(g/L)

葡萄糖 20，酵母膏 8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH 自然，0.08 MPa滅菌 15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養

接1環生長良好的斜面酵母至200 mL種子培養基中，30℃，200 r/min培養20 h。

3.1.4 豬的室間隔缺損模型 這類模型非常重要，由于這類疾病模型屬于自然發生，能夠有效模擬人類收縮功能正常的心力衰竭模型[18-19]。

1.2.2 液化

將木薯粉碎，過40目篩，料水比為1∶3(g∶mL)。物料混合均勻后用質量分數為30%的H2SO4溶液調pH至6.0，按10 U/g木薯粉加入耐高溫α-淀粉酶，于沸水浴中液化，冷卻后用稀碘液作指示劑判斷液化終點。

1.2.3 糖化與發酵

將1.2.2中得到的液化液冷卻至60℃，用30%H2SO4調節料液pH至實驗設定pH，分裝于三角瓶，0.08 MPa條件下滅菌15 min;滅菌后冷卻至30℃，按130 U/mL培養基添加糖化酶，接入10%(v/v)酵母種子液和0.5 g/L尿素，根據實驗設定添加一定量的Na2S溶液，于30℃恒溫培養箱中靜置發酵。

1.3 分析方法

酒精、甘油、葡萄糖含量利用高效液相色譜檢測，檢測儀器及色譜條件為:美國Dionex UltiMate 3000 HPLC，示差折光檢測器，日本 Shodex RI-101，紫外檢測器Dionex UltiMate 3000，分析柱Bio-Rad HPX-87 H離子交換柱，柱溫60℃，流動相0.005 mol/L稀H2SO4，流速 0.6 mL/min，進樣量 20 μL。

酵母數測定:血球計數板法。

硫化物含量測定:甲基藍比色法[10］。

2 結果與討論

2.1 硫化物對酒精發酵臨界抑制濃度的確定

在發酵起始pH 4.0條件下，考察了硫化物對酒精發酵的臨界抑制濃度。實驗中添加的硫化物(Na2S)濃度分別為 0、1.2、2.4、3.6、4.8 和 6.0 mmol/L，實驗結果如圖2所示。

圖2 硫化物對酒精發酵過程中CO2生成量的影響

隨著培養中硫化物濃度的增加，酒精發酵時間不斷延長(圖2)。與對照相比，硫化物濃度為1.2 mmol/L時，發酵時間沒有延遲;而當硫化物濃度為6.0 mmol/L時，發酵時間從對照的48 h延長至60 h。從CO2生成曲線上看，為避免硫化物對酒精發酵產生抑制，培養基中硫化物的濃度不能超過1.2 mmol/L。為了探索S2-對酒精發酵抑制的機理，考察了不同起始pH條件下，S2-對酒精發酵中CO2生成、酒精產量、甘油產量以及生物量的影響;此外，還考察了添加時間對S2-抑制性的影響。

2.2 不同初始pH值下硫化物對酒精發酵的影響

根據酵母生長和酒精發酵條件，實驗中確定的pH分別為4.0、5.0和6.0，硫化物濃度分別為0、6、12、18和24 mmol/L，每組3個平行，實驗結果如圖3所示。

在所有pH條件下，S2-均造成了酒精發酵啟動的延遲，這種延遲現象隨著S2-濃度增大以及培養基pH的下降而更加顯著(圖3)。例如，當發酵初始pH為4.0，S2-濃度分別為 0、6、12、18、24 mmol/L 時，酒精發酵起始時間分別延遲了0、12、72、174和252 h;當硫化物濃度為12 mmol/L時，隨著培養基pH由6.0下降至4.0，酒精發酵起始時間從24 h延長至72 h。在酒精發酵過程中，酵母的對數生長期與CO2生成基本是同步的，這說明，硫化物抑制了酵母的生長。從CO2生成曲線上看，硫化物只是推遲了酒精發酵開始的時間，而對酒精發酵時CO2的生成速率沒有明顯影響。這意味著，硫化物存在時，酒精發酵時間的延長主要是由于酒精發酵啟動被延遲造成的。

圖3 不同發酵初始pH時硫化物對酒精發酵過程中CO2生成的影響

H2S是一種二元弱酸，在溶液中分子態形式的比例主要由環境pH所決定，計算公式:

根據計算結果，在硫化物濃度一定時，H2S占總硫化物的比例隨著環境pH的下降而增高(表1)，這也是低pH條件下，硫化物抑制性更強的原因。需要指出的是，由于H2S的pKa1較大，即使環境pH為6.0時，H2S占總硫化物的比例也超過91.8%，這也是高pH條件下硫化物依然顯示出很強抑制性的原因。

表1 不同pH條件下培養基中硫化物濃度與其對應的H2S濃度

硫化物存在時，不僅會明顯延長酒精發酵時間，而且對酒精發酵中的產物具有明顯影響，表現為酒精產量和生物量下降以及甘油產量的上升(表2)。以發酵初始pH為5.0為例，當S2-添加量從0 mmol/L增加到24 mmol/L時，酒精產量由90.46 g/L下降至85.06 g/L，下降6.0%;酵母數量由4.57×108/mL下降至1.93×108/mL，下降57.8%;甘油產量由6.93 g/L增加至10.55 g/L，增加52.2%。硫化物可以抑制酵母生長，并減少酒精合成，但是顯著促進了甘油的生成。酵母數量的減少主要是因為H2S的存在抑制了其生長，前期研究表明，高濃度硫化物存在時甚至會造成酵母細胞破裂死亡[12］。通常認為，甘油的生產與生物量成正相關關系，但硫化物存在，生物量的下降并未造成甘油的下降，其原因需要進一步分析。

表2 不同初始pH條件下硫化物對酒精發酵的影響

2.2 硫化物的添加時間對酒精發酵的影響

為了進一步確定S2-對酒精發酵的抑制機理，確定抑制酒精發酵的具體階段，設定在發酵不同時間向培養基中添加一定濃度的S2-。研究接種后0 h、6 h、12 h時加入S2-，每組3個平行。硫化物添加濃度為12 mmol/L(發酵起始pH 4.0及5.0)和24 mmol/L(發酵起始pH 6.0)，發酵過程中CO2產量變化如圖4所示。

由圖4可知，不同發酵初始pH條件下，S2-對酒精發酵的影響呈現出了相同的規律。接種后加入S2-的時間越早對酒精發酵的抑制作用越強，一旦體系中加入了S2-，培養基CO2生成量即與對照產生差異。以6 h時添加S2-為例，添加硫化物前，CO2生成量變化曲線與對照完全重合;添加S2-后培養基CO2生成量明顯較對照減少。接種后12 h添加S2-的發酵實驗也表現出相同規律。結果同時表明，硫化物對酒精發酵的抑制性隨著添加時間的推遲而減弱。例如，當初始pH為4.0時，硫化物添加時間為0 h時，到接種后80 h才開始酒精發酵，發酵時間長達126 h，而當硫化物添加時間為接種后12 h，CO2生成速度略有減慢，發酵時間縮短至72 h。這種變化規律表明，S2-的加入會嚴重影響酵母細胞的增殖。發酵初期酵母會大量繁殖滿足發酵生產需要，而在發酵進行一段時間后，酵母的生長繁殖相對穩定，添加S2-對發酵的影響大大減小。說明S2-主要的影響體現在對酵母增殖上，而不是發酵性能上。

表3所示為不同發酵初始pH條件下，在發酵不同時間添加相同濃度的S2-對酒精發酵的影響。結果顯示，與對照相比，隨著添加時間的推后，酒精產量逐漸增大，甘油產量越少。說明培養基中的S2-對酒精發酵的影響主要在發酵的前期，而發酵的前期主要是酵母大量繁殖的過程，由此也可以看出，是由于酵母的生長受到了抑制而導致酒精發酵異常。而且，在發酵開始后加入S2-已經有CO2產生，產生的可以將H2S部分帶出，減少發酵培養基中殘留的H2S進而減輕了H2S對酒精發酵的抑制作用[13］。

3 結論

同一發酵初始pH值下，隨著S2-濃度的增大抑制現象越明顯。表現為在初始pH為4.0時，S2-濃度從6 mmol/L增加到24 mmol/L時，發酵延遲時間從20 h延長到260 h左右，發酵結束時酵母數減少量可達50%，酒精產量減少了8.5 g/L。不同發酵初始pH值加入等濃度S2-的發酵實驗對比可以得到，pH值越小對發酵的抑制作用越強。同樣加入24 mmol/L的S2-，pH值為4.0和6.0時發酵延遲時間分別為260 h左右和110 h左右。而當pH值越低等濃度的S2-轉化為H2S的量就越多，說明對酵母發酵有抑制作用的是H2S。

由同一發酵初始pH值在接種后不同時間加入相同濃度S2-的發酵實驗結果可以得到，不同時間加入對酒精發酵的抑制作用不同，接種后越早加入硫化物其抑制作用越大。說明H2S主要影響了發酵前期酵母的生長繁殖過程，加入時間越晚，酵母生長發酵過程產生越多的CO2將H2S吹脫帶出發酵體系，減少了對酒精發酵的抑制。

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ABSTRACTEthanol fermentation could be inhibited by sulfide，which is harmful to the process of ethanol methane coupled fermentations.Compared to the control，at pH 4.0 and with 24 mmol/L sulfide existed，ethanol fermentation time was prolonged from 48 to 318 h，ethanol concentration was decreased from 90.73 to 82.28 g/L，yeast cell number was declined from 3.78×108to 2.20×108cell/mL，and glycerol concentration was increased from 6.99 to 11.02 g/L.Increased glycerol production could contribute to the decreased ethanol production when sulfide existed.Inhibition of sulfide to ethanol fermentation was weakened as delay of addition，because sulfide could escape from the fermentation broth with CO2as the form of H2S.At pH 4.0，critical inhibition concentration of sulfide to ethanol fermentation was 1.2 mmol/L.cassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Key wordscassava，fuel ethanol，sulfate，sulfide，critical inhibition concentration

Effect of Sulfide on Ethanol Fermentation in the"Ethanol Methane Coupled Fermentations"Process

Liu Hui-hui1，2，Jiang Li1，2，Zhang Cheng-ming1，2，Zhang Jian-hua1，2，Mao Zhong-gui1，2
1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(毛忠貴教授為通訊作者)。

*國家863計劃項目(2008AA10Z338);江蘇省科技支撐計劃(SBE201171007)

2012-02-07，改回日期:2012-04-09