大豆球蛋白自組裝聚集及凝膠特性*

何秀婷，楊曉泉，張晉博

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)

大豆球蛋白自組裝聚集及凝膠特性*

何秀婷，楊曉泉，張晉博

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)

研究了在低pH值、低離子強度下，分別加熱誘導不同濃度11S(大豆球蛋白)和7S(大豆伴球蛋白)自組裝纖維化聚集體的形成。通過平均粒徑和Thioflavin T(硫磺素T)熒光光譜，對自組裝纖維化聚集體的性質進行表征，并對其熱致凝膠的流變學，硬度和微結構特性進行考察。結果表明:在低pH值、低離子強度的誘導條件下，蛋白濃度對自組裝聚集的形成起著關鍵作用，隨著誘導濃度的增大，蛋白的纖維化聚集越明顯，7S比11S更容易形成纖維化聚集。在酸性環境下，大豆球蛋白的纖維化聚集程度越高，越有利于熱致凝膠網絡結構的形成。在相同的預處理條件下，11S自組裝凝膠硬度強于7S。掃描電鏡結果顯示7S自組裝凝膠的網絡結構較11S致密，但有序性較11S低。

大豆球蛋白，自組裝，纖維化，聚集體，凝膠特性，網絡結構

分子自組裝是一種生命體系中的普遍存在現象。所謂的分子自組裝是在平衡的條件下，分子間通過非共價(氫鍵、疏水作用、靜電作用、范德華力等)相互作用自發組合形成的結構明確、穩定、并具有某種特定功能的分子聚集體或超分子結構。這種結構富含高度有序的β折疊片層結構，具有一定的強度和穩定性[1］，因此分子自組裝聚集體可作為一類非常有研究價值的新型材料。

近年來國外廣泛研究了動物蛋白(β-乳球蛋白[2］，卵清蛋白[3-4］，乳清蛋白[5］和牛血清蛋白[6］)在酸性、低離子強度和加熱的條件下通過非共價鍵進行組裝形成纖維狀結構。通過自組裝，可改變蛋白形成凝膠的濃度和凝膠的性質。大豆蛋白作為一種營養豐富、來源廣泛和價格低廉的植物蛋白，是優質動物蛋白的替代源。關于大豆蛋白自組裝纖維化聚集機理，Akkermans等[7］研究了大豆分離蛋白和11S球蛋白在低pH值、低離子強度下形成線性聚集體的輪廓、長度和厚度。Tang等[8］報道了11S和7S熱致自組裝纖維的形成過程，發現7S的自組裝纖維化聚集形成能力明顯強于11S。但在酸性條件下關于大豆蛋白纖維化聚集體凝膠性質的研究還鮮有報道。

本文以大豆球蛋白11S和7S為研究對象，誘導2種球蛋白在低pH值和低離子強度下自組裝聚集體的形成，并以這些聚集體為原料制備凝膠，研究凝膠的流變學性質，并通過掃描電鏡對凝膠的微觀結構進行觀察，比較兩種蛋白的自組裝聚集能力和凝膠特性。從微觀和宏觀的角度表征大豆蛋白自組裝聚集體的性質，旨在為大豆蛋白的凝膠性在食品生產中的廣泛應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆低溫脫脂豆粕(白豆片):由山東新嘉華有限公司提供，白豆片粉碎后過80目篩，并儲存于4℃下密閉容器中，豆粉蛋白質含量為55.8%;化學試劑均為分析純。

CR22G高速冷凍離心機(日本Hitachi);Deltat-24/LSC冷凍干燥機(德國Christ公司);F-7000熒光分光光度計(日本Hitachi);2501PC紫外-可見分光光度計(日本島津公司);Nano-ZS＆MPT-2 Zeta電位及納米粒度分析儀(英國Malvern公司);TAXT2i質構儀(英國Micro System公司);HAAKE RS 600流變儀(德國Haake公司);掃描電鏡(日本，HitachiTM3000)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆11S和7S的制備

采用Nagano法來提取大豆豆粕中的蛋白質[9］，制備出的11S和7S組分經冷凍干燥備用。杜馬斯燃燒法測定11S和7S的蛋白質含量分別為(92.01±0.40)%和(86.09±0.61)%;電泳條帶及光密度顯示其純度均為95%以上。

1.2.2 預熱處理制備大豆蛋白原料

室溫條件下，稱取適量的大豆蛋白11S和7S樣品分散于pH值為2.0的去離子水中，配成一定濃度的蛋白分散液，攪拌2 h充分溶解。用2 mol/L HCl微調蛋白溶液的pH值為2.0，pH值穩定后(10000 g，30 min，20℃)去除蛋白質分散液中的不溶成分。采用Lowry法測定上清液的蛋白質含量[10］。

11S 和 7S 蛋白分散液(10、20、40、60、80 mg/L)在85℃預熱反應20 h，然后冷卻至室溫，經凍干后作為制備大豆蛋白凝膠的原料。

1.2.3 大豆蛋白凝膠的制備

分別將上述制備的11S和7S原料配制成80 mg/L的蛋白質溶液，添加NaCl至50 mmol/L攪拌充分溶解，95℃水浴加熱30 min，然后迅速冷卻，置于4℃冰箱保存。

1.2.4 預熱處理大豆蛋白原料性質的表征

大豆蛋白原料動態光散射(DLS，dynamic light scattering)粒度的測定:將經過預熱前處理的11S和7S樣品配成濃度為5 mg/mL的蛋白溶液，采用Nano-ZS納米粒度分析儀，測定樣品的平均粒徑，各重復3次。

Th T熒光分析:制備0.8 mg/mL(2.5 mmol/L)的Thioflavin T(Th T，Sigma)熒光染料儲備液(10 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，pH 7.2)，避光保存不超過1周。分析時將Th T儲液稀釋成50 μmol/L的工作液。將預熱處理的大豆蛋白溶解，通過0.22 μm的濾膜，調節蛋白濃度為5 mg/mL的溶液，測定時將40 μL樣品溶液與4 mL的Th T工作液混合反應2 min后進行測量。儀器的激發波長為440 nm，發射波長掃描范圍為450～600 nm，激發和發射狹縫均為5 nm。

1.2.5 大豆蛋白凝膠特性的測定

凝膠流變性質的測定:將1 mL大豆蛋白分散液均勻置于哈克流變儀的平行版上，其間隙設置為1 mm，除去過量的樣品并添加一層薄硅油以防止水分的蒸發。平衡后溶液自25℃升溫至95℃恒溫30 min，然后降溫至25℃，記錄此過程樣品隨時間變化的彈性模量(G')的變化趨勢。

TPA(texture profile analysis)分析凝膠硬度的測定:采用2次壓縮模式，壓縮變形為樣品高度的30%，探頭使用P/10，觸發力為5 g，間隔時間為3 s，測定時探頭下行速度采用0.5 mm/s，探頭進入凝膠過程檢測速度為0.5 mm/s，檢測溫度為室溫。重復3次的平均值作為測定結果。

掃描電鏡(SEM):將1.2.3制備好的凝膠用濾紙吸去其表面的水分，經液氮淬冷和冷凍干燥后，對干燥后的凝膠進行切片，表面噴金，掃描電鏡15 kV電壓下觀察凝膠微觀結構。

2 結果與討論

2.1 低pH值條件下熱處理不同濃度大豆球蛋白的粒度分析

動態激光光散射(DLS)分析結果表明，在低pH值下隨著加熱蛋白濃度的增加，聚集體的流體動力學半徑和光強呈現逐漸增加的趨勢。

由表1所示，隨著預熱蛋白濃度的增大，粒度和光強值逐漸增大，并存在顯著性差異(P＜0.05)。球蛋白分子的自組裝過程通常在遠離蛋白質的等電點(低pH值)的條件下進行。在低pH值低離子強度的條件下加熱，蛋白質首先發生酸水解，同時變性暴露出更多的疏水基團，蛋白質分子表面帶有較高的正電荷，分子間強烈的靜電排斥占主導地位，而且由于離子強度較低，這種電荷作用沒有被有效屏蔽，使起始連接過程有限，以線性連接為主。當自組裝纖維聚集的晶核形成后，連接位點隨之增多，組成線性聚集的多肽更容易連接到晶核上。隨著處理濃度的增大，分子間碰撞的機會增多，能促進蛋白纖維化聚集形成的速度，生成的聚集體粒徑越大。

表1 低pH值條件下熱處理不同濃度大豆蛋白的粒度分析

2.2 低pH值條件下加熱預處理不同濃度大豆球蛋白ThT熒光分析

圖1 低pH條件下熱處理不同濃度大豆蛋白的Th T熒光光譜圖

Th T是一種陽離子的苯并噻唑，能與蛋白質淀粉樣纖維(β-折疊結構)發生高度特異性結合，在480 nm附近熒光強度升高的熒光染料[11］，并隨著β-折疊的數量增加熒光強度，能廣泛應用于檢測蛋白質自聚集體的二級結構研究。圖1是不同濃度的11S和7S在pH 2.0的條件下加熱后的聚集體的熒光光譜圖，蛋白經過加熱后，其熒光強度均有增強，說明均有纖維化聚集體的生成，隨著蛋白濃度的增加熒光強度逐漸增強，當熱處理時的蛋白濃度高于4%時，熒光強度有明顯的增高，這表明蛋白濃度在自組裝的過程中起了關鍵的作用。Akkermans等研究了大豆蛋白在低pH值條件下纖維化聚集的形成過程，結果顯示蛋白濃度越高越有利于纖維化聚集體的產生[7］。這可能是由于在較高的濃度下，蛋白分子間碰撞的幾率大，更容易聚集形成晶核，促進蛋白自組裝纖維化的過程。在同一誘導濃度下，7S球蛋白的熒光強度比11S球蛋白要高，尤其是當預處理濃度大于4%時更為明顯，這表明7S球蛋白比11S球蛋白在低pH值的條件下更容易形成纖維狀聚集。Tang等研究表明，在pH 2.0高于大豆蛋白變性溫度條件下加熱，由于7S球蛋白中帶電的氨基酸遠多于11S球蛋白，7S球蛋白比11S球蛋白更容易發生水解，產生更多有利于形成自組裝結構的肽段，因此其生成自組裝纖維結構能力和蛋白的水解程度有關[8］。

2.3 蛋白熱凝膠動態過程流變學分析

圖2 大豆蛋白纖維化聚集體熱凝膠彈性模量G’值的動態變化

圖2 為經過預熱處理后不同大豆蛋白原料制備的凝膠的G’-T測試曲線，通過彈性模量G’的變化反應最終形成凝膠的質量。根據溫度的不同，凝膠形成的動態過程可分為3個階段:(1)從25℃到95℃升溫過程⑵95℃保溫30 min過程;(2)從95℃到25℃冷卻過程。在第一階段升溫加熱的過程中，低濃度(1%和2%)前處理組G’的變化不大，在高濃度處理組(≥4%)G’隨著加熱時間延長而增長，說明同種蛋白原料的纖維化聚集程度越高，其開始形成凝膠網絡結構越快。當預處理濃度≥4%，7S蛋白G’起始點遠高于11S蛋白表明7S纖維化聚集體在沒有加熱和加熱初期其本身具有一定的弱凝膠性。這可能與7S線性聚集體溶液的粘度和流動性有關，Akkermans[7］等研究表明，含有7S的分離蛋白比11S形成線性聚集的程度要高，7S和11S線性聚集體粘度在較高的剪切速率范圍內，7S線性聚集體的粘度要高于11S[8］。另從圖2也可以看出，11S形成凝膠后的G’普遍高于7S，這可能與11S分子含有較多的二硫鍵和巰基，有助于形成凝膠網絡結構。

2.4 蛋白凝膠硬度的分析

圖3 大豆蛋白纖維化聚集體凝膠的硬度

圖3 為低pH值條件下不同濃度預熱處理11S和7S蛋白熱致凝膠的硬度。用預處理濃度(1%和2%)的自組裝聚集體蛋白原料制備的凝膠呈高粘度溶膠狀態，并未真正成膠，不能進行凝膠硬度的分析。當預處理濃度達到4%或以上可以形成凝膠，隨著預處理濃度的增加，凝膠的硬度逐漸增加。在相同的預處理濃度下，11S蛋白凝膠硬度明顯強于7S蛋白(P＜0.05)，這跟流變學的結果相一致。對比由大豆蛋白無規則顆粒型聚集體誘導形成的凝膠[12］，線性聚集體的凝膠硬度相對較弱。這是由于2種聚集體凝膠的形成機理不同所致，在低pH值、低離子強度下形成的是高度定向有序，具有念珠狀網絡結構的凝膠，通常是透明或半透明的弱凝膠;而當pH值靠近蛋白質的等電點或者高離子強度足以屏蔽靜電作用時，則形成隨機聚集的不透明凝膠[13］。

2.5 掃描電鏡圖譜分析

圖4為用在不同濃度條件下誘導線性聚集體為原料制備所得熱致凝膠掃面電鏡圖。在10 mg/L和2 mg/L較低濃度下誘導的11S和7S線性聚集體經凍干后配制成80 mg/L的蛋白溶液不能通過熱誘導形成凝膠網絡結構，這可能在pH=2.0的條件下遠離蛋白的等電點，蛋白分子間有較大的靜電排斥作用，而蛋白的線性聚集程度低不足以克服靜電相互作用，不利于蛋白分子通過疏水作用形成凝膠。如圖4所示，當原料的預處理濃度越高所形成凝膠的微觀結構越有序、越致密。預處理濃度為40 mg/L時，含蛋白80 mg/L的11S和7S線性聚集體能在加熱的條件下形成凝膠，但凝膠強度較弱，因此在冷凍干燥和切片的過程中結構容易被破壞，松散成碎片(圖4-a、圖4-d)。當預處理濃度提高到60 mg/L，線性聚集體能逐漸形成凝膠網絡結構，圖4-b、圖4-d顯示11S形成的網孔結構比較有序，而7S凝膠有較多大小不一的孔洞，微觀結構致密但有序性較11S低。在低pH值條件下加熱誘導蛋白自組裝聚集體的形成，當蛋白濃度超過某一濃度(臨界濃度)才可以形成纖維凝膠[14］。蛋白聚集體的形態和凝膠的網絡結構會隨著蛋白質濃度和靜電相互平衡作用力的變化而變化[15-16］。因此，在較低的離子強度下，低pH值環境成為靜電斥力的主要驅動力，自組裝聚集體的含量和體積越大，其在加熱的條件下發生疏水性相互作用的機會越多，進而形成蛋白質凝膠。靜電相互作用和疏水相互作用在蛋白凝膠形成的過程中是2種互相抗衡的力量，當兩者達到平衡，凝膠網絡結構形成。由圖4-b、圖4-e、圖4-f也可以看出，大豆蛋白自組裝聚集體凝膠呈片層結構，層與層之間的連接較弱，這也可能是造成凝膠強度較弱的原因。

圖4 大豆蛋白纖維化聚集體凝膠結構掃描電鏡圖

3 結論

(1)在pH值為2.0的低離子強度條件下，加熱誘導大豆球蛋白11S和7S的自組裝聚集體，蛋白濃度對自組裝聚集的形成起著關鍵的作用，隨著誘導濃度的增大，蛋白的纖維化聚集越明顯。在相同的誘導條件下，7S球蛋白比11S球蛋白更容易形成纖維化聚集。

(2)在酸性環境下，球蛋白的纖維化聚集程度越高，越有利于熱致凝膠網絡結構的形成。在本研究中，當前期纖維化聚集體的誘導濃度≥40 mg/L時，含蛋白80 mg/L的11S和7S線性聚集體均能在加熱的條件下形成凝膠。而當前處理濃度較低時(10 mg/L和20 mg/L)，由于原料的纖維化聚集程度較低，只能形成高粘度溶膠狀態，并未真正成膠。在相同的預處理條件下，11S自組裝凝膠硬度強于7S。7S自組裝凝膠的網絡結構較11S致密，但有序性較11S低。

[1]Zhao X J，Zhang X G.Self-assembling Nanopeptides become a new type of biomaterial[J］.Polymers for Regenerative Medicine，2006，203:145-170.

[2]Leonard M C，Cecile V，Renate G，et al.Mesoscopic structure and viscoelastic properties of β-lactoglobulin gels at low pH and low ionic strength[J］.Food Hydrocolloids，2002，16(3):207-213.

[3]Veerman C，Sagis L M C，van der Linden E.Gels at extremely low weight fractions formed by irreversible self-assembly of proteins [J］.Macromolecular Bioscience，2003，3(5):243-247.

[4]Weijers M W，van de Velde F，Stijnman A，et al.Structure and rheological properties of acid-induced egg white protein gels[J］.Food Hydrocolloids，2006，20(2/3):146-159.

[5]Bolder S G，Hendrickx H，Leonard M C S，et al.Fibril assemblies in aqueous whey protein mixtures[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(12):4229-4234.

[6]Veerman C，Sagis L M C，Heck J，et al.Mesostructure of fibrillar bovine serum albumin gels[J］.International Journal of Biological Macromolecules，2003，31(4/5):139-146.

[7]Akkermans C，Goot A J，Venema P，et al.Micrometersized fibrillar protein aggregates from soy glycinin and soy protein isolate[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(24):9877-9882.

[8]Tang Chuan-he，Wang Chang-sheng.Formation and characterization of amyloid-like fibrils from soy β-conglycinin and glycinin[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(20):11058-11066.

[9]Nagano T，Hirotsuka M，Mori H，et al.Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin form soybeans[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40(6):941-944.

[10]Lowry O H，Rosenbrough H J，Lewis A，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193，265-275.

[11]Naiki H，Higuchi K，Matsushima K，et al.Fluorometric examination of tissue amyloid fibrils in murine senile amyloidosis:use of the flurescent indicator，thioflavine T[J］.Lab Invest，1990，62(6):768-773.

[12]李云，華欲飛，李向紅.大豆蛋白預先熱聚集對其凝膠性質的影響[J］.食品科技，2007，2:29-32.

[13]Tombs M P.Gelation of globular protein[J］.Faraday Discuss Chemistry Society，1974，57:158-164.

[14]Zhang Y H，Tang C H，Wen Q B，et al.Thermal aggregation and gelation of kidney bean(Phaseolus vulgaris L.)protein isolate at pH 2.0:Influence of ionic strength[J］.Food Hydrocolloids，2010，24(4):266-274.

[15]Cho J H，Sato S，Horny J C，et al.Electrostatic interactions in the denatured state ensemble:Their effect upon protein folding and protein stability[J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2008，469(1):20-28.

[16]Carrick L M，Aggeli A，Boden N，et al.Effect of ionic strength on the self-assembly，morphology and gelation of pH responsive [beta-sheet tape-forming peptides[J］.Tetrahedron，2007，63(31):7457-7467.

ABSTRACTThe self-assembly fibrillar aggregations of soy glycinin and β-conglycinin at pH 2.0，85 ℃ with various protein concentrations were investigated using dynamic light scattering(DLS)and Thioflavin T fluorescence techniques.The heat-induced gelation properties including rheology，hardness and network structure of different fibrillar aggregations were characterized simultaneously.The results showed that protein concentration played an important role in the self-assembly aggregate formation at low pH and low ionic strength.The data suggested fibrillar aggregation progressively increased with the increasing of protein concentration.β-Conglycinin exhibited a higher ability to form thermally fibrillar aggregates than glycinin.The increasing degree of fibrillar aggregate was favorable for enhancing the network structure of heat-set gels.The hardness of glycinin fibril gel was stronger than that of β-conglycinin.Scanning electron microscopy observation indicated that the network of β-conglycinin fibril gel was more compact than glycinin，while the latter one was more in order.

Key wordssoybean protein，self-assembly，fibril，aggregates，gelation properties，network structure

Research of Soybean Proteins Self-assembly Fibrils and Their Gelation Properties

He Xiu-ting，Yang Xiao-quan，Zhang Jin-bo
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

博士研究生(楊曉泉為通訊作者)。

*國家自然科學基金資助項目(21076087)

2012-03-07，改回日期:2012-05-17