β-乳球蛋白包埋花色苷C3G對其抗氧化活性的保護*

杜文凱，蔡烈偉，李博，金建昌，杜琪珍

1(浙江工商大學食品化學研究所，浙江 杭州，310012)

2(漳州科技職業學院，福建 漳州，363202)

β-乳球蛋白包埋花色苷C3G對其抗氧化活性的保護*

杜文凱1，蔡烈偉2，李博1，金建昌1，杜琪珍1

1(浙江工商大學食品化學研究所，浙江 杭州，310012)

2(漳州科技職業學院，福建 漳州，363202)

利用熱激的β-乳球蛋白(β-Lg)與矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)共組裝形成納米粒以保護C3G的抗氧化活性。溶液pH值為2.5～6.5、蛋白熱激溫度為30～85℃及β-Lg與C3G不同摩爾比例(1∶2～1∶32)對納米體系的粒徑、Zeta電位、包埋率及單位蛋白載藥量具有顯著影響。在pH 6.5時能夠形成穩定的納米分散體，在熱激溫度85℃、β-Lg與C3G摩爾比為1∶2時，β-Lg對C3G的抗氧化活性具有最好的保護作用。

納米粒，β-乳球蛋白，矢車菊素-3-葡萄糖苷，抗氧化活性

矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)是目前研究最為廣泛的花色苷單體之一，存在于黑米、越橘、桑葚等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、抗心血管疾病、抗過敏、減肥等多種生物功能[1-3］。然而花色苷易受光、溫度、pH、氧等外界因素的影響而發生變化[4］。其次由于其在腸胃停留時間有限、滲透性不足以及受pH、酶等影響[5-6］，口服生物利用度低。因此，花色苷在普通和保健食品等領域的應用有較大的局限性。

納米粒子是粒徑介于1～100 nm的材料，具有獨特的表面效應和量子尺寸效應[7］。納米技術在醫藥學和食品科學領域具有廣闊的應用前景。通過將功能因子包裹于納米粒子內部或吸附于納米粒子表面，能夠提高生物活性成分的穩定性，促使其活性的最大發揮。

目前關于花色苷的包埋主要采用微膠囊，所制備顆粒均未達到納米級[8-10］。本研究采用熱誘導的β-LG與C3G共組裝制備β-LG-C3G的納米分散體，并研究了β-LG-C3G納米分散體對C3G抗氧化活性的保護作用。研究結果對于花色苷在食品飲料、保健品等領域的應用具有重要意義。

1 材料與儀器設備

1.1 實驗材料

矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)由本實驗室自黑米提取物中分離制備，純度為94.4%[11］;β-乳球蛋白(β-Lg)(純度＞90%)購自Sigma公司;色譜純甲醇、乙腈購自天津四友精細化學品有限公司;其它試劑均為分析純，購自華東醫藥股份有限公司;MILIPORE超濾濃縮離心管(3000MWCO)購自上海歐韋達儀器科技有限公司;實驗用水均為超純水。

1.2 儀器設備

TS-100B恒溫搖床，上海善志儀器設備有限公司;AY-120電子天平，日本SHIMADZU;超高壓液相色譜;UPLC，美國WATERS公司;JB-3渦旋儀，上海雷磁新涇儀器有限公司;VIS-723G紫外可見分光光度計，上海之信儀器有限公司;Nano-ZS型粒度儀，英國Malvern公司。

2 實驗方法

2.1 β-LG–C3G納米分散體系的制備

參照Shpigelman等的方法[8］并略做改進。配置pH 6.0～7.0的30 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(Na2HPO4-NaH2PO4)，并用磷酸調節pH 6.0的 緩沖液至pH 2.5～5.5備用。β-Lg溶于含有0.02%NaN3的(PBS)溶液中，室溫下于200 r/min振蕩12 h使其充分溶解。C3G溶于30 mmoL、pH2.5的磷酸緩沖液，現配現用。β-Lg溶液(1.9 mL)在不同溫度下水浴熱激20 min，加入0.1 mL C3G溶液，快速渦旋混合20 s，并迅速置于25℃的水浴中冷卻。β-Lg終濃度為5.0 mg/mL(0.27 mmoL)。

本研究考察下述3個制備因素對β-LG–C3G納米粒的影響:(1)β-Lg溶液的pH值(pH 2.5，4.5，5.5，6.5);(2)β-Lg 溶液熱激溫度(30℃，55℃，70℃ ，85℃);(3)β-Lg與 C3G的摩爾比例(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)。

2.2 粒徑及Zeta電位測定

溶液中顆粒的粒徑和Zeta電位采用英國Malvern公司的Nano-ZS型粒度儀進行測定，散射角為173°，測試溫度為25℃。

2.3 包埋率的測定

取2 mL β-LG-C3G溶液于超濾濃縮離心管，4℃條件下4000 g離心30 min，收集離心后的液體，超高效液相色譜(UPLC)定量檢測超濾離心液中游離C3G的含量。UPLC檢測條件為:流動相，A相:V(無水甲酸)∶V(水)=8.5∶91.5，B 相:V(無水甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=8.5∶25∶25∶91.5;B 相梯度洗脫條件:0～10 min，6%～30%;10～12 min，30%～6%;12～15 min，6%。色譜柱為BEH-C18柱(1.7 μm，50 mm×2.1 mm)。檢測波長 280 nm，流速0.3 mL/min，進樣量5μL。配置 31.25～500 μg/ml共5個濃度梯度C3G標準液，得標準曲線Y=2×10-8X+0.0105(R2=0.996)，其中 X 為峰面積，Y 為C3G 濃度(μg/mL)。

2.4 抗氧化活性測定

抗氧化活性采用FRAP法測定[12］。取0.1 mL待測溶液加入到2.9 mL FRAP反應液(由300 mmol/L pH 3.6的醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1的比例混合而成，現用現配)混勻后于37℃水浴孵育30 min，在593 nm處測定吸光值。

使用pH 2.5緩沖液配置20 mmol/L C3G溶液用于納米粒制備，制備方法同2.1。β-LG-C3G溶液置于30℃環境中，采用2只紫外燈(30 W/只)持續照射加速花色苷降解，每隔24 h取樣進行FRAP測定。

2.5 統計分析

本研究所有樣品重復測定3次。兩組樣品間的差異顯著性分析采用 Student’s t檢驗，組間多重比較采用 LSD檢驗。所有分析使用統計軟件 SAS V8進行。

3 結果與分析

3.1 溶液pH值對β-LG-C3G納米體系的影響

pH值(2.5～6.5)對β-LG-C3G納米粒粒徑、Zeta電位、包埋率和單位蛋白載藥量的影響如表1所示。β-LG-C3G納米粒和純β-LG溶液在pH 4.5時出現混濁現象，平均粒徑均達幾百納米;而在其它pH條件下澄清，粒徑小于20 nm。pH 6.5的粒徑大約為pH 2.5時的 1.5～2倍。當加熱至 70～80℃，pH 2.5和中性條件下的β-LG發生聚集形成可溶的多聚體，而在等電點附近(pH 5.1)會形成肉眼可見的蛋白沉淀[13-14］。本研究結果與這些報道相一致。

Zeta電位是反應納米體系穩定性的一個重要指標，高Zeta電位使小顆粒間斥力增加，不易聚集，從而更有利于穩定性。通常認為，穩定體系納米粒Zeta電位應大于 +30 mV或小于-30 mV[15］。β-LG–C3G和β-LG納米粒的Zeta電位均隨著pH值的升高向負值轉變，在 pH 6.5時 達到最大值，表明此時納米體系最為穩定(表1)。

C3G包埋率和單位蛋白裝載量隨著pH的升高而增大，在pH 6.5時分別達到79.7% 和86.1 nmol/mg(表1)。這是因為在酸性條件下，β-Lg呈現閉合構象，疏水結構藏于蛋白內部，無法和小分子接觸;而在中性條件下，蛋白內部的疏水結構域暴露，從而與配體小分子結合力增強[16］。

綜合上述結果，β-LG-C3G在近中性條件下制備能夠達到較好的澄清度、穩定性和較高的包埋率。花色苷通常在酸性條件下穩定，而在中性和堿性條件下容易降解[4］。研究結果表明，β-LG-C3G納米粒可用于一些近中性的食品飲料中。

表1 pH值對β-LG-C3G顆粒粒徑、Zeta電位、C3G包埋率和裝載量的影響(熱激溫度70℃，β-LG與C3G摩爾比1∶2)

3.2 熱激溫度對β-LG-C3G納米體系的影響

蛋白熱激溫度(30～85℃)對β-LG-C3G納米粒粒徑、Zeta電位、包埋率和單位蛋白載藥量的影響如表2所示。隨著熱激溫度的升高，納米粒粒徑、負Zeta電位值、C3G包埋率和單位蛋白裝載量均增加。表明在測試范圍內較高的熱激溫度更有利于β-LGC3G納米粒的形成。中性條件下的β-LG在加熱到70℃以上時，二聚體解聚成單體，原本位于蛋白內部的巰基和二硫鍵暴露，單體蛋白之間通過這些基團發生連接聚集;溫度越高，這種效應越顯著[17］，從而導致顆粒粒徑隨熱激溫度升高而增加。

表2 熱激溫度對β-LG-C3G顆粒粒徑、Zeta電位、C3G包埋率和裝載量的影響(pH 6.5，β-LG與C3G 摩爾比 1∶2)

3.3 β-Lg與C3G摩爾比例對β-LG-C3G納米體系的影響

β-Lg與 C3G 摩爾比例(1∶2～1∶32)對 β-LGC3G納米粒粒徑、Zeta電位、包埋率和單位蛋白載藥量的影響如表3所示，隨著C3G對β-Lg的摩爾比例升高，粒徑、負Zeta電位值和單位蛋白載藥量都出現明顯升高，而包埋率卻依次下降。多酚類物質在低濃度時與蛋白形成可溶復合體，而在高濃度時能夠使蛋白發生聚集甚至沉淀。在中性條件下多酚類物質的羥基發生質子化，使氧原子帶負電荷，因此結合的C3G越多，納米粒上的負電荷就越多[18］。

表3 摩爾比例對β-LG-C3G顆粒粒徑、Zeta電位、C3G包埋率和裝載量的影響(熱激溫度70℃ ，pH 6.5)

3.4 β-LG-C3G納米粒的抗氧化活性

圖1 不同熱激溫度對β-LG-C3G納米粒的抗氧化活性保護作用的影響(pH 6.5，β-LG與C3G摩爾比1∶2)

熱激溫度(30～85℃)對β-LG-C3G抗氧化活性的保護作用如圖1所示，隨著時間的延續，相對于自由C3G，各熱激溫度下的β-LG-C3G抗氧化活性的降低趨勢均有所減緩，熱激溫度越高，這種保護作用越明顯。

β-LG與 C3G 摩爾比例(1∶2～1∶32)對 β-LGC3G抗氧化活性的保護作用如圖2所示，β-LG相對于C3G的比例越高，對其抗氧化活性的保護作用越明顯，在摩爾比例為1∶16和1∶32時，保護作用已經不明顯。

4 結論

圖2 不同摩爾比例對β-LG-C3G納米粒的抗氧化活性保護作用的影響(熱激溫度85℃ ，pH 6.5)

溶液pH值、蛋白熱激溫度以及 β-Lg與C3G的摩爾比例對β-Lg-C3G納米體系的粒徑、Zeta電位、包埋率及單位蛋白載藥量都有顯著影響。當pH值為6.5、熱激溫度為85℃、β-Lg與C3G的摩爾比為1∶2時，β-Lg和C3G能夠形成穩定的納米分散體。研究表明β-Lg可作為納米材料保護C3G穩定性和抗氧化活性，對C3G及其它花色苷在食品飲料等領域的應用具有重要意義。

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ABSTRACTCyanidin-3-glucoside(C3G)was coated by heat treatment with β-lactoglobulin(β-Lg)for the preservation of antioxidant activity.The effects of pH(2.5-6.5)，heating temperature of β-Lg(30-85 ℃)and the molar ratio of β-Lg to C3G(1∶2-1∶32)on the properties of β-Lg-C3G complexes were studied.All three factors significantly influenced the particle size，zeta-potential，entrapment efficiency of C3G and C3G encapsulation with β-Lg particles.Stable and clear solution could be obtained at pH 6.5.The highest protection of EGCG antioxidant activity was obtained with β-Lg heated at 85 ℃ and the molar ratio of 1∶2(β-Lg∶C3G).

Key wordsnanoparticle，β-lactoglobulin，cyanidin-3-glucoside(C3G)，antioxidant activity

Preservation of Cyanidin-3-glucoside Antioxidant Properties by Coating with β-lactoglobulin Nanoparticles

Du Wen-kai1，Cai Lie-wei2，Li Bo1，Jin Jian-chang1，Du Qi-zhen1
1(The Institute of Food and Chemistry，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310012，China)
2(Zhangzhou College of Science and Technology，Zhangzhou 363202，China)

碩士研究生(杜琪珍教授為通訊作者，E-mail:qizhendu@163.com)。

*教育部博士點基金項目(0113326110001)，浙江省自然科學基金重點項目(Z12C160014)，國家科技支撐計劃課題(2011BAD01B03-5)

2012-03-26，改回日期:2012-04-28