濃香型白酒酒醅真菌群落結構及其變化規律*

侯海波，羅惠波，黃治國，葉光斌

(四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢，643000)

濃香型白酒酒醅真菌群落結構及其變化規律*

侯海波，羅惠波，黃治國，葉光斌

(四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢，643000)

利用PCR-DGGE技術研究了濃香型白酒酒醅真菌群落結構及其發酵過程中的變化規律，結果發現，所有酒醅樣品均出現9～19條較清晰的條帶，其中第2、5、8、9、14、17號條帶在所有樣品中均有檢出，且優勢度較高;所有樣品生物多樣性指數都在1.68～2.61之間。發酵前期，多樣性指數呈先下降后上升的趨勢，發酵至第21～49天基本保持平穩，第56天時，多樣性指數到達最低值，第63天回升之后多樣性指數持續下降，發酵至第84天時略有回升;不同發酵時期酒醅真菌DGGE圖譜相似性指數較低，表明不同發酵時間酒醅樣品真菌群落間差異較大。

白酒酒醅，真菌，PCR-DGGE，18S rDNA，微生物群落

濃香型白酒的生產過程與微生物菌群的演化交替密不可分，窖池微生物經過長期的馴化和發展，慢慢形成了獨特的微生物群落。酒醅富含豐富的微生物，除了細菌，古菌等原核微生物外，還有真核微生物，這些微生物的代謝產物是濃香型白酒酒體風味與口感形成的重要物質基礎[1］。因此，探討發酵過程中濃香型白酒酒醅微生物群落特性的差異及其變化規律，對濃香型白酒生產有著重要的指導意義。

前人采用平板培養，從酒醅中已分離出酵母屬、霉菌屬等真菌類群[2］。但是以形態學和生理生化指標為基礎的真菌檢測和分類方法較為復雜，而且所得出的結論難免與實際情況有所偏差。近些年來分子生物學的方法越來越多地應用于微生物群落的研究，有學者利用基因克隆研究酒醅真菌群落的多樣性[3］，也有學者利用PCR-SSCP探討濃香型大曲真核微生物群落的多樣性[4］，以及利用PCR-DGGE分析油脂廢水處理系統中酵母菌群落結構等[5］，這些技術在真菌多樣性的研究中取得了可觀的成果。

本試驗利用PCR-DGGE技術，研究發酵過程中酒醅真菌群落結構及其變化規律，為中國白酒生產研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

酒醅樣品采自四川旭水酒業有限公司生產窖池中上位置(距窖壁1m，距窖頂0.5m)，迅速置于冰盒運回實驗室，-20℃保藏。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司;去離子甲酰胺，德國AppliChem。

1.1.3 主要儀器

PCR儀，美國 BIO-RAD公司My cycle;DGGE電泳儀，美國 BIORAD公司，Dcode;高速冷凍離心機，德國Hettich公司，UNIVERSAL 32R;凝膠成像系統，美國 SIM公司，Bio-Best200E。

1.2 方法

1.2.1 酒醅微生物總DNA提取

用SDS-酚氯仿抽提法[6］提取酒醅微生物基因組DNA，然后用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度和純度，保存于-20℃備用。

1.2.2 引物設計與合成

采用真菌通用引物 nu-SSU-0817-5’:5＇-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3＇和 nu-SSU-1196-3’-GC:5＇CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGTCTGGACCTGGTGAAGTTTCC-3＇。擴增18S rDNA 的 V6-V8 區[7］，引物由上海英俊生物技術公司合成。

PCR 反應體系為50 μL:1.0μL Taq酶(5U/μL)，5.0 μL 10× buffer，3.0 μL MgC12(25 mmol/L)，4.0 μL dNTPs Mixture(各 2.5 mmol/L)，引物(10 μmol/L)各 2.0 μL，2.0 μL 模板 DNA(100 ng/L)，31.0 μL滅菌雙蒸水。PCR擴增程序:95℃預變性9 min;PCR循環:95℃1min，48℃1 min，72℃1 min，一共35 個循環;然后72℃延伸10 min。PCR產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染后拍照。

1.2.3 DGGE分析

在50 μL PCR 產物中加入8 μL6×loadding buffer混勻，取20 μL加入40%～55%(100%的變性劑中含有7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺)梯度變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯度為38∶2)的加樣孔中，膠的規格為20 cm×20 cm，厚1 mm，在1×TAE電泳液中電泳，電泳溫度為60℃，先用200V電泳5 min，然后130 V電泳14h，銀染后拍照。

1.2.4 數據分析

研究群落多樣性的方法很多，本研究主要用豐度(S)、優勢度、樣品間相似性指數(Cs)和shannon-wiener指數(H)來表示。通過quantity one軟件對DGGE圖譜進行分析。具體過程如下:

(1)豐度(S):用DGGE圖譜中條帶的個數表示。

(2)優勢度:用某一特定條帶的峰面積占樣品總體峰面積的百分數來表示。

(3)Shannon-Wiener多樣性指數[8］:反映群落種類與均勻度的混合參數，即種類數目多，可增加多樣性;同樣，種類之間個體分配的均勻性增加也會使多樣性提高。

式中，H為Shannon-Wiener多樣性指標值;pi為第i個物種所占的百分比，即是第i種的個體數與個體總數的比例;S為樣品中含有多少種不同的物種的數量，即該樣品總DGGE條帶數。

⑷相似性用索倫森配對相似性系數(Sorenson Pairwise Similarity Coefficient)[9］來計算:

式中，Cs為索倫森配對相似性系數;a為某一樣品的PCR-DGGE圖譜的條帶數目;b為另一樣品的PCR-DGGE圖譜的條帶數目;j為2個泳道所共有條帶的數目。

2 試驗結果與分析

2.1 酒醅真菌18S rDNA PCR擴增結果

酒醅樣品微生物總DNA光吸收比值OD260/OD280均在1.70～1.90之間。用引物nu-SSU-0817和nu-SSU-1196-GC擴增酒醅真菌18S rDNA，得到460bp左右的片段(圖1)，符合引物設計的片段。

2.2 酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE圖譜

從酒醅真菌18S rDNA PCR-DGGE圖譜(圖2)中可以看出，所有樣品均出現9～19條較清晰的條帶，說明各樣品18S rDNA PCR產物通過DGGE得到了較好的分離。

圖1 酒醅細菌18S rDNA PCR擴增結果

圖2 酒醅真菌群落DGGE圖譜

2.3 酒醅真菌DGGE圖譜豐度變化規律

本試驗分析了DGGE圖譜中真菌豐度的變化規律，結果發現:豐度總體上呈先下降后上升，而后保持平穩，再下降的趨勢，后期基本平穩。在發酵第1天時，豐度達到最大值19;在發酵第56天時，豐度值達到較低值，僅為9;到發酵第77，84天時，豐度值基本保持平穩。

2.4 酒醅真菌DGGE圖譜條帶優勢度變化規律

本試驗分析了DGGE圖譜中主要條帶優勢度的變化規律(表1、圖 3)，結果發現:第 2、5、8、9、14、17號條帶在所有樣品中均有檢出，其中第2、5、8號條帶優勢度隨著發酵時間的增加總體呈先下降后上升再下降并保持平穩的變化趨勢，到發酵后期有波動;第2、5、8號條帶的優勢度分別在發酵第70天，第77天，第84天達到最大值。9、14、17號條帶優勢度隨著發酵時間的增加總體呈先上升后下降，再上升又下降最后上升的變化趨勢。第9、17號條帶的優勢度變化趨勢較為相似，分別在發酵第21天，第70天達到最大值。第14號條帶的優勢度在發酵第35天達到最大值;第3、6號條帶所代表的真菌類群，僅在發酵前期樣品中有檢出。第21、22號條帶所代表的真菌類群，只在發酵中后期酒醅樣品中有檢出。第20號條帶所代表的真菌類群，只在發酵中期酒醅樣品有檢出。

圖3 酒醅真菌群落條帶優勢度變化規律

2.5 酒醅真菌DGGE圖譜多樣性指數變化規律

本試驗分析了DGGE圖譜真菌群落多樣性指數的變化規律，結果發現:酒醅樣品真菌多樣性指數都在1.68～2.61(圖4)。隨著發酵時間的開始，多樣性指數略呈先下降趨勢，發酵第21天時，多樣性指數開始回升，之后保持平穩，發酵第42天時，多樣性指數達到最大值2.61。到第49天時，多樣性指數開始下降，發酵第56天時，多樣性指數達到最小值1.68，第63天回升后又持續下降，到發酵第84天時，多樣性指數略有回升。

圖4 酒醅真菌群落多樣性指數的變化規律

2.6 酒醅真菌DGGE圖譜相似性指數

本試驗分析了酒醅真菌群指紋圖譜的相似性(表2)，結果發現:發酵第21天和第28天的相似性指數為0.69，發酵第35天和第42天相似性指數為0.76，發酵第42天和第49天相似性指數為0.78，其他許多樣品間的相似性指數都在0.6以下。基于相似性數據，構建UPGMA聚類圖(圖5)，結果發現，發酵第35，42，49天聚為一大支，發酵第70，84天聚為一大支。

圖5 酒醅真菌群落UPGMA聚類圖

表2 不同發酵時期酒醅真菌群落相似性

3 討論

3.1 酒醅真菌DGGE圖譜豐度

生物多樣性研究中，豐度代表一定區域的物種數。DGGE將無法檢測DNA在基因組中的含量少于1.5%的種群，因此DGGE圖譜所反映的是樣品中的優勢菌群[8］。邢德峰等[10］研究表明，當 DNA 片段為450～500 bp左右片段的，分類信息相對更為豐富。本試驗采用真菌通用引物nu-SSU-0817-5’和nu-SSU-1196-3’-GC擴增酒醅真菌18S rDNA，擴增后的DNA片段為460 bp，所得的酒醅樣品真菌DGGE圖譜的豐度為9～19，實現了酒醅真菌的較好分離。研究結果表明:不同發酵時間樣品的條帶數差異較大，優勢條帶在6～8條之間，其中既有所有樣品的共有條帶，也有部分樣品的共有條帶，還有個別樣品的特異條帶;隨著發酵時間的增加，樣品條帶豐度總體上呈先下降，再上升，保持平穩，再下降的趨勢，到發酵后期趨于穩定。

3.2 酒醅真菌DGGE圖譜條帶優勢度

條帶的優勢度反映的是該條帶的量在整個樣品中所占的比例大小[9］。對具有代表性的優勢條帶的優勢度分析，可在一定程度上代表酒醅細菌群落在發酵過程中演變情況。本試驗分析了酒醅真菌DGGE圖譜的優勢度，結果發現:在所有的酒醅樣品DGGE圖譜中，都檢出第 2、5、8、9、14、17 號6條共有條帶，且相對于其他條帶而言，優勢度較高，說明這6條帶所代表的真菌類群，可能在窖池微生態系統中起重要的作用。其中第2、5、8號條帶的優勢度變化趨勢在發酵前中期非常相似，后期都有波動;第9、17號條帶優勢度的變化趨勢在發酵全過程中都較為相似。

3.3 酒醅真菌群落多樣性

生物多樣性是生態系統穩定性的基礎，較高水平的生物多樣性有利于生態系統功能的發揮[11］。本試驗研究發現:酒醅真菌DGGE圖譜的H值為1.68～2.61。發酵前期，隨著發酵時間的增加，真菌多樣性指數呈先遞減后上升的趨勢。這可能是由于在發酵過程中，發酵產生的乙醇以及酸類物質會在一定程度上影響真菌群落多樣性，多樣性指數在發酵第21～49天基本保持平穩，在發酵第56天達到最小值，第63天略有回升后又持續下降，發酵后期厭氧環境的加劇以及營養關系的多樣化，都會在一定程度上影響到酒醅真菌群落的多樣性。第84天有所回升，這可能是由于發酵后期環境微生物遷移進入酒醅中，使得酒醅微生物多樣性指數有所升高。

3.4 酒醅真菌群落相似性

相似性指數主要反映各樣品條帶數量之間的相似性關系，它是一個最基本的多樣性分析指數。王娜等[12］利用DGGE技術分析扇貝養殖海區真核浮游生物種群多樣性，發現月份相近的樣品中浮游生物微生物群落的相似性較好。施思等[13］利用PCR-DGGE技術分析盛夏習酒酒醅的微生物菌群結構群落的相似性，發現入窖酒醅上下層及出窖酒醅上下層相似系數較高，菌群結構差異不大，而入窖與出窖酒醅的相似系數較低，說明入窖與出窖酒醅菌群結構已存在較大差異。本試驗對微生物群落相似性進行分析，發現窖池中上位置酒醅發酵過程中真菌群落間的相似性系數多數較低，在0.6以下，這表明在發酵過程中，不同發酵時間酒醅樣品真菌群落間存在一定的差異。

[1]趙東，喬宗偉，彭志云.濃香型白酒發酵過程中酒醅微生物區系及其生態因子演變研究[J］.釀酒科技，2007(7):37-39.

[2]陳敏.濃香型酒發酵過程中糟醅微生物動態研究[J］.釀酒科技，1998，89(5):26-28.

[3]張文學，喬宗偉，胡承，等.濃香型白酒糟醅中真菌菌群的多樣性分析[J］.四川大學學報:工程科學版，2006，38(5):98-100.

[4]羅惠波，黃治國，李浩，等.濃香型大曲真核微生物群落的PCR-SSCP解析[J］.中國釀造，2009，209(8):42-45.

[5］ 呂文洲，劉英，朱建林.PCR-DGGE用于油脂廢水處理系統中酵母菌群落結構解析[J］.微生物學通報，2008，35(8):1198-1202.

[6]陳美軍，孔繁翔，陳非洲，等.太湖不同湖區真核微型浮游生物基因多樣性的研究[J］.環境科學，2008，29(3):769-775.

[7］ 范曉旭.利用PCR-DGGE法對樟子松有機凋落物層真菌多樣性及高頻菌株酶活研究[D］.哈爾濱:黑龍江大學，2010.

[8]羅惠波，甄攀，黃治國.濃香型白酒窖池細菌群落[J］.微生物學通報，2010，37(11):1621-1627.

[9]黃治國，甄攀，羅惠波.濃香型白酒窖池古菌群落研究[J］.西南大學學報:自然科學版，2010，32(12):91-96.

[10］ 邢德峰，任南琪.應用DGGE研究微生物群落時的常見問題分析[J］.微生物學報2006，46(2):331-335.

[11]趙平，彭少麟，張經煒.恢復生態學-退化生態系統生物多樣性恢復的有效途徑[J］.生態學雜志，2000，19(1):53-58.

[12］ 王娜，蔡玉勇，李赟，等.應用DGGE技術分析扇貝養殖海區真核浮游生物種群多樣性[J］.中國海洋大學學報，2010，40(12):51-56.

[13]施思，鄧宇，李波，等.DGGE法在盛夏習酒酒醅的微生物菌群結構解析中的應用[J］.釀酒科技，2010(3):51-53.

ABSTRACTThe variational regularity of fungi community in fermentation process of fermented grains of luzhou-flavor liquor were analyzed by PCR-DGGE technique in the test.The results showed that 9～19 clear bands were shown clearly in these grains samples，wherein No.2，5，8，9，14，17 bands were significantly detected in all samples.The diversity index of these samples ranged from 1.68 to 2.61.At the early stage of fermentation，the diversity index of samples generally decreased at first and then followed by increasing.The diversity index was stable from Day 21 to Day 49 and reached the lowest value on Day 56.It increased at Day 63 and then decreased.It slightly rose on Day 84.The similarity indexes of PCR-DGGE patterns of samples from different stages were low，which indicated that the fungi community of Fermented Grains at different fermentation stage had some difference.

Key wordsliquor fermented grains，fungi，PCR-DGGE，18S rDNA，microflora

Fungi Community Structure and Variational Regularity of Fermented Grains of Luzhou-flavor Liquor

Hou Hai-bo，Luo Hui-bo，Huang Zhi-guo，Ye Guang-bin
(Liquor-making Biotechnology＆ Application Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan University of Science＆ Engineering，Zigong 643000，China)

在讀碩士研究生(羅惠波教授為通訊作者)。

*四川省科技廳應用基礎項目(No.07JY029-026);四川理工學院引進人才項目(No.2007-18)

2011-11-25，改回日期:2012-03-21