Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達

雷麗華，鄭仁朝，柳志強，黎小軍，鄭裕國

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州，310014)

Thermomyces lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因克隆及在大腸桿菌中的表達

雷麗華，鄭仁朝，柳志強，黎小軍，鄭裕國

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州，310014)

Thermomyces lanuginosus脂肪酶(簡稱TLL)是具有重要商業應用價值的脂肪酶之一。運用RT-PCR技術，從Thermomyces lanuginosus ZJB09222基因組中克隆得到885 bp脂肪酶基因cDNA序列，其結構基因編碼蛋白包含292個氨基酸。將脂肪酶基因cDNA序列開放閱讀框克隆到大腸桿菌表達載體pET-28b中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，構建了基因工程菌E.coli BL21/pET28b-TLL。誘導表達后SDS-PAGE電泳顯示該脂肪酶分子量約為32 ku。篩選獲得廉價重組菌培養基，表達條件優化結果表明，當OD600約為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，在28℃誘導培養7 h，酶活達到41 U/mL。

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脂肪酶(lipase，EC 3.1.1.3)是一類能夠催化長鏈甘油三酯水解生成甘油二酯和羧酸及其逆反應的絲氨酸水解酶[1］。同時，它們也能夠在有機溶劑中高效催化各種非天然底物的酯化、轉酯、氨解等反應。因此，脂肪酶在食品、洗滌、紡織、飼料、能源等加工業中應用廣泛[2］，是最重要的工業酶制劑之一。隨著生物催化技術在支撐工業可持續發展中重要性的不斷顯現，脂肪酶作為高效、高立體選擇性生物催化劑的功能日益受到重視，其中熱穩定、高活力的脂肪酶具有無可比擬的開發和應用前景。

疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種分布廣泛，生長上限溫度較高的真菌，能夠產生系列具有重要工業價值的熱穩定纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶等[3］。T.lanuginosus脂肪酶(TLL)屬于堿性脂肪酶，最適反應pH 8.0，在pH值4.0～11.0范圍內較穩定，最適反應溫度60℃，在65℃下仍能保持較高活性[4］，用于食品加工、油脂化學品工業、造紙工業、洗滌和生物表面活性劑合成等行業[5］。在有機合成領域，該脂肪酶用于糖衍生物的區域選擇性水解、外消旋體拆分[6］和前手性酯的不對稱水解等[7-8］。與其他嗜熱真菌脂肪酶相比，TLL 活性最高[9］。

由于嗜熱真菌的特殊屬性，野生菌發酵工業化生產TLL存在較多困難。采用分子生物學手段，構建適于產業化應用的工程菌就成為必然要求。1998年，Boel最先克隆了T.lanuginosus脂肪酶的mRNA序列(AF054513);1998年，申請美國專利“Humicola lanuginose lipase produced in Aspergillus”，用異源絲狀真菌表達生產脂肪酶。Novozymes在2002年成功將T.lanuginosus脂肪酶與Fusarium oxysporum脂肪酶融合在一起構成“hybrid”脂肪酶，并在Aspergillus oryzae中表達成功。該重組脂肪酶已經成為洗滌劑用酶的主力。2004年 Prathumpai等人用黑曲霉表達TLL[10］。他們利用米曲霉淀粉酶啟動子和黑曲霉葡萄糖苷酶終止子，將疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因(AF054513)在黑曲霉中表達。但SDS-PAGE分析顯示，絕大部分脂肪酶結合在細胞壁上，未能分泌。國內鄭艷等根據已報道TLL序列(AF054513)設計特異引物，在畢赤酵母中成功表達[11］。

與其它表達系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養條件簡單，培養周期短，抗污染能力強，成本低等特點，是基因表達技術中發展最早和目前應用最廣泛的經典表達系統。本研究擬從實驗室保存的疏棉狀嗜熱絲孢菌中克隆出脂肪酶基因，在E.coil BL21(DE3)中表達，并優化重組菌的表達條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

Thermomyces lanuginosus ZJB09222由本實驗室保藏;大腸桿菌JM109、BL21(DE3)、質粒pET-28b由本實驗室保存;質粒 pMD18-T Vector購自 TaKaRa公司。

1.1.2 酶與化學試劑

T4 DNA連接酶、限制性內切酶NcoⅠ和HindⅢ購自Fermentas公司，膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒為Axygen公司產品，RT-PCR試劑盒、IPTG、氨芐青霉素、卡那霉素、DL2000 DNA Maker、Taq DNA 聚合酶等試劑購自 TaKaRa公司。對硝基苯乙酸酯(pNPA)、對硝基苯丁酸酯(pNPB)、對硝基苯月桂酸酯(pNPL)和對硝基苯棕櫚酸酯(pNPP)均購自Sigma公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列測定由上海桑尼有限公司完成。其它化學試劑均為分析純。

1.1.3 培養基與培養條件

T.lanuginosus ZJB09222培養基:PDA培養基。

本研究所用大腸桿菌培養基(pH 7.0，g/L)如下:

LB培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10;IG培養基:蛋白胨 20，酵母粉 12，NaCl 10，甘油 10 mL，KH2PO41.5，K2HPO42.3，MgSO4·7H2O 0.25;TB 培養基:蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油6，NaCl 10，KH2PO42.4，K2HPO4·3H2O 12.5;2-YT 培養基:蛋白胨 16，酵母10，NaCl 5;DB培養基:蛋白胨 7，酵母粉 8，甘油 3，K2HPO42，MgSO42，NaCl 10;DLB 培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10;DGL培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘油 5;DST培養基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，淀粉5;DG培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，葡萄糖5;DM培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，麥芽糖5;DS培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，蔗糖5;DF培養基:蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，D-果糖 5;DL 培養基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，乳糖5;DMA培養基:蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 10，甘露醇5;DBM培養基:蛋白胨7，酵母粉8，甘露醇 3，K2HPO42，MgSO42，NaCl 10。

除LB、IG、TB和2-YT培養基中的蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司外，其余培養基中的蛋白胨和酵母粉均為國產生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 真菌總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

TRIzol法提取總RNA。采用RT-PCR的方法從T.lanuginosus ZJB09222菌中分離脂肪酶基因，使用TaKaRa公司RT-PCR試劑盒進行cDNA第一鏈的合成，反應體系及條件均參照試劑盒的使用說明。并經紫外檢測和0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其大小及濃度。-20℃保存，待用。

1.2.2 全長cDNA的克隆

以cDNA第一鏈為模板，利用PCR方法擴增脂肪酶cDNA序列。所用引物序列為:上游引物ZS(5'-ATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3');下游引物GY(5'-CGCCGCGCACTAAAGACATGA-3')[11］。 PCR 程 序為:94℃預變性4min;94℃1min，52℃1min，72℃1min，30個循環;72℃延伸10 min。利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒將PCR產物進行凝膠回收后，與pMD18-T載體16℃連接，轉化大腸桿菌JM109感受態，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上。挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定后，將陽性克隆送樣測序。

1.2.3 TLL成熟肽基因的分離與大腸桿菌基因工程菌的構建

根據已獲得的脂肪酶全長cDNA序列，設計表達引物(LEIEP1:5'-AG GCCATGGGTAGTCCTATTCGTCGAGAG-3'，LEIEP2:5'-CCC AAGCTTTTACGCCGCGCACTAAAGAC-3')，用于去除非編碼區序列和信號肽序列。為保證該脂肪酶基因定向插入載體中，在上下游引物兩端分別引入NcoⅠ和HindⅢ酶切位點(加下劃線部分)。PCR程序同前所述，退火溫度為55℃。PCR產物經AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌JM109，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上。挑取單菌落，進行菌落PCR鑒定，陽性克隆經測序證實。將經測序驗證含TLL成熟肽基因的質粒pMD18-T/TLL用NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，回收插入片段，并與同樣雙酶切的大腸桿菌表達質粒pET-28b進行連接，構建重組質粒pET28b-TLL，轉化 E.coli BL21(DE3)，經 Kan抗性篩選，進行菌落PCR鑒定，重組質粒酶切鑒定和測序證實。TLL大腸桿菌基因工程菌命名為E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL。

1.2.4 重組菌的誘導表達

通過測定重組脂肪酶酶活以及生物量，篩選較優發酵培養基，即將重組菌分別在37℃振蕩培養過夜，以體積分數1%的接種量轉接于50 mL含Kan的基礎培養基中，200 r/min培養至OD600在0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，28℃誘導培養10 h后，離心收集菌體。菌體用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)溶解并混合均勻，稀釋一定倍數后，進行酶活測定。

1.2.5 表達產物SDS-PAGE分析

誘導后的培養物10000 r/min離心5 min，棄上清并收集菌體，再取適量無菌水重懸菌體，取20 μL菌懸液加入等體積的2×Loading buffer，混勻后煮沸10 min。離心后取上清液進行SDS-PAGE分析(80 V，120 min)，電泳結束后用考馬斯亮藍染色3 min，再用脫色液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)∶V(蒸餾水)=1∶1∶8)］脫色。

1.2.6 脂肪酶活力測定

用無水乙醇溶解一定量pNPL，配成2.5 mmol/L底物溶液。取80 μL菌液加入840 μL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)中，30℃ 金屬浴上保溫2min，再加入80 μL底物溶液充分振蕩混勻2 min后，用酶標儀檢測405 nm下的吸光值。

酶活(U)單位定義:在 pH 8.0，30℃條件下，每分鐘分解pNPL產生1 μmol對硝基苯酚(黃色)所需的酶量定義為1個酶活單位。

2 結果與分析

2.1 TLL基因的克隆

TRIzol法提取總 RNA。使用Eppendorf公司的核酸蛋白測定儀估測RNA質量，測定A260/A280比值為2.0，可見得到的RNA較均一。由于甲醛變性凝膠電泳繁瑣且上樣量較大，故采用普通電泳檢測，即0.9%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性(圖1 A)。通過RT-PCR得到cDNA第一條鏈(圖1 B)，用特異性引物對ZS和GY擴增出一條約0.9 kb的目的條帶(圖2)，片段大小與已報道的來源于T.lanuginosus脂肪酶基因(EU022703.1)大小相近，測序后證實僅有2個堿基不同，即619位堿基T變為C，636位堿基G變為A，翻譯后的氨基酸序列也有兩氨基酸不同，即207位L變為P，213位G變為R。至此，已成功分離出T.lanuginosus ZJB09222脂肪酶基因全長cDNA序列。

2.2 重組菌的構建

將PCR擴增得到的TLL成熟肽編碼基因克隆到克隆載體pMD18-T，CaCl2法轉化E.coli JM109，通過菌落PCR，酶切并測序驗證，得到重組質粒并命名為pMD18-T/TLL。經過酶切、連接，克隆到含強啟動子的大腸桿菌表達載體 pET-28b，構建重組質粒pET28b-TLL，轉化E.coli BL21(DE3)，經IPTG誘導，表達出分子量約32 ku的目的蛋白(圖3)，檢測具有脂肪酶活性，成功構建TLL基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL。

2.3 重組菌的表達條件優化

圖1 T.lanuginosus RNA電泳分析(A)和RT-PCR產物電泳分析(B)

圖2 全長cDNA序列PCR擴增產物電泳分析

圖3 誘導產物SDS-PAGE分析

為了考察重組脂肪酶對脂肪酸碳鏈長度的選擇性，選用2.5 mmol/L對硝基苯乙酯(pNPA)、對硝基苯丁酸酯(pNPB)、對硝基苯月桂酸酯(pNPL)、對硝基苯棕櫚酸酯(pNPP)作為底物，檢測重組脂肪酶對不同底物的催化能力，結果如圖4。以pNPA、pNPB為底物時的活力僅有以pNPL為底物時的10%～40%。可見重組脂肪酶對較長碳鏈脂肪酸酯的催化效率高，即對較長碳鏈脂肪酸有較高的親和性。因此，選擇pNPL作為酶活測定底物。

圖4 重組脂肪酶對不同鏈長脂肪酸酯的催化活性

2.3.1 不同培養基的選擇

為了提高重組脂肪酶的表達量，考察了部分已報道大腸桿菌培養基對酶活的影響，如圖5所示。結果表明，添加甘油能促進菌體生長，酶活也得到提高。其中在IG培養基誘導培養下，酶活和干重均達到最高，其次是DB和DMA培養基。由于進口蛋白胨、酵母粉價格較高，進一步以DB、DBM、DGL和DMA培養基為基礎，分別比較0.2 mmol/L IPTG和1%乳糖的誘導效果，結果如圖6所示。1%乳糖誘導蛋白表達量僅為0.2 mmol/L IPTG誘導下的50%。在IPTG誘導下，DB培養基中重組脂肪酶活力最高，達26 U/mL。

圖5 不同培養基對重組菌生長和產酶的影響

2.3.2 誘導條件的優化

在基礎培養基基礎上，以IPTG為誘導劑，考察了不同誘導劑濃度、誘導溫度及誘導時間對產酶的影響(如圖7)。確定該重組菌誘導表達最佳條件為:OD600為0.6～0.8時，加入 IPTG至終濃度為 0.1 mmol/L，28℃誘導7 h，脂肪酶的酶活最高達到41 U/mL，比優化前提高了1.6倍。

3 討論

圖6 不同誘導劑對重組菌生長和產酶的影響

圖7 誘導劑濃度(A)、誘導溫度(B)及誘導時間(C)對重組酶表達的影響

疏棉狀嗜熱絲孢菌是一種分布廣泛、最適生長溫度較高的真菌，能夠產生具有重要工業價值的熱穩定脂肪酶。但是野生菌生產脂肪酶需在高溫下培養(60℃)，造成實際生產中菌體培養困難、能耗高。此外，其工業化生產還受到如誘導劑高黏度油脂與產物分離困難等因素的限制。因此，應用分子生物學手段，將嗜熱真菌熱穩定脂肪酶基因導入中溫單細胞微生物中高效表達成為十分有效的途徑。

雖然黑曲霉和畢赤酵母表達系統都成功實現了高活性TLL的表達[10-11］，但由于黑曲霉和畢赤酵母都屬于好氧微生物，發酵過程通氧量大，且黑曲霉和畢赤酵母表達系統誘導周期長，導致生產成本相對較高。而大腸桿菌表達系統具有操作簡單、發酵周期短、易于大規模培養，成本低廉等優點，在工業化產酶中具有十分顯著的優勢。

本研究成功構建了E.coil BL21(DE3)/pET28b-TLL基因工程菌，首次實現了TLL在大腸桿菌中的重組表達，確定了廉價培養基和較優表達條件，當OD600約為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，在28℃誘導培養7 h，酶活達到41 U/mL，為高效、低成本TLL的工業化生產和應用奠定了基礎。

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ABSTRACTThermomyces lanuginosus lipase is one of the most important industrial enzymes.Based on published DNA sequence，the full length cDNA of the lipase was cloned using RT-PCR method.It revealed that the cDNA of the T.lanuginosus lipase gene encoded a protein lipase of 292 amino acid residues.The open reading frame of the cDNA was cloned into the plasmid pET-28b，which was then transformed into E.coil BL21(DE3)strain.The Mr of the expression product was 32 ku by SDS-PAGE.The recombinant E.coli BL21/pET28b-TLL exhibited highest activity of 41 U/mL at 28℃ for 7 h induction with 0.1 mmol/L IPTG after screening of the best medium.

Key wordslipase，Thermomyces lanuginosus，cloning，Escherichia coli，induction expression

Gene Cloning of Lipase from Thermomyces lanuginosus ZJB09222 and Expression in Escherichia coli

Lei Li-hua，Zheng Ren-chao，Liu Zhi-qiang，Li Xiao-jun，Zheng Yu-guo
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

碩士研究生(鄭裕國教授為通訊作者)。

2011-12-21，改回日期:2012-03-01