根霉胞內α-半乳糖苷酶的分離及其酶學性質

王劍鋒，陳今朝，李江，饒軍

1(東華理工大學生物系，江西 撫州，344000)

2(長江師范學院生命科學與技術學院，重慶，408100)

根霉胞內α-半乳糖苷酶的分離及其酶學性質

王劍鋒1，陳今朝2，李江1，饒軍1

1(東華理工大學生物系，江西 撫州，344000)

2(長江師范學院生命科學與技術學院，重慶，408100)

根霉Rhizopus sp.A01的菌絲體破碎液依次經過三相分離、Sephadex G-100凝膠過濾獲得了電泳純的α-半乳糖苷酶，純化了54.8倍，總酶活回收率達到27.3%，在SDS-PAGE上顯示相對分子質量為85.6 ku的單一條帶，凝膠過濾表明該酶表觀相對分子質量為302 ku。該酶水解對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最適pH值為4.5，最適溫度為55℃，表觀Km值為(0.242±0.027)mmol/L，表觀kcat/Km值為4.089×105L/(mol·s);對蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用，水解速度依次為138.3μmol/(h·mg)、19.7μmol/(h·mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的顯著激活，但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等離子的強烈抑制。該酶活性在pH4.0～8.2保持穩定，在50℃時保溫90 min，殘余酶活達到了48%。

棉子糖，蜜二糖，α-半乳糖苷酶，三相分離

豆渣是大豆加工的棄余物，含有蛋白質19%～22%，木質纖維素51%～61%，磷、鉀、鈣、鎂等灰分3%，少量的VB和大豆黃酮苷等[1］營養成分，來源廣泛，是食品和飼料加工的重要原料。但豆渣中同時存在的許多抗營養因子卻降低了豆渣的生物可利用度。含有末端α-半乳糖殘基的棉子糖同系物是植物糖類的轉運和貯存形式，廣泛分布于植物界，幾乎存在于植物的各個部分[2］;它們在單胃動物消化道中不能被內源消化酶消化利用，卻被腸道產氣微生物發酵利用，致使單胃動物出現腸脹氣、腹泄等癥狀，最終導致食物的消化利用率大幅下降[3］，因而蜜二糖、棉子糖等是一類普遍存在的抗營養因子，在大豆中約占7.1%左右[3］。已有研究表明[4］，在食品和飼料中添加或利用 α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，αGAL，EC 3.2.1.22)加工能顯著降低這類抗營養因子的不利影響，原因在于αGAL能以外切方式水解非還原端的α-半乳糖苷鍵，而且對多種具有末端α-半乳糖殘基的寡糖、糖脂均有水解活性。許多傳統發酵豆制品的制作提示，利用產αGAL的菌株發酵豆渣也是去除α-半乳糖苷類脹氣因子的有效途徑。基于豆渣固態發酵的工藝要求和菌株安全性的考慮，文中利用分離自市售甜酒曲的1株根霉菌Rhizopus sp.A01發酵豆渣制取α-半乳糖苷酶，結合三相分離和凝膠過濾對Rhizopus sp.A01產生的胞內α-半乳糖苷酶αGAL-R2進行了分離純化和酶學性質研究，以期為理解利用根霉去除豆渣中α-半乳糖苷類脹氣因子的機制提供資料，也為食品飼用αGAL的開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

根霉A01(Rhizopus sp.A01)，東華理工大學生物系實驗室分離自市售甜酒曲。

1.2 根霉A01胞內α-半乳糖苷酶的制備與分離

1.2.1 α-半乳糖苷酶的制備

Rhizopus sp.A01孢子接種在豆渣培養基(2%豆渣，pH 6.5)中28℃、100 r/min培養3 d;發酵醪液經絲網過濾收集菌絲體，菌絲體經蒸餾水洗滌多次并壓干水分后分散在適量pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎，超聲功率800 W、時間20 min、破碎3 s暫停3 s;菌絲破碎液12000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 α-半乳糖苷酶的分離

取一定體積冷藏粗酶液，高速離心(12000 r/min，10 min)取上清液;上清液中溶入(NH4)2SO4至15%(w/v)，加入等體積叔丁醇，混勻、靜置10 min，高速離心(12000 r/min，10 min)后去掉中間相;下相中再次溶入(NH4)2SO4至25%(w/v)，與上相的等體積叔丁醇重新混勻、靜置10 min，高速離心(12000 r/min，10 min)后取中間相，并溶解在適量pH 7.5、20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，即得αGAL-R2酶液;取1.0 mLαGAL-R2酶液進行凝膠過濾(Sepha-dex G-100)，以 pH 7.5、20 mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4緩沖液洗脫，流速9.0 mL/h，每3.0 mL收集1管，檢測蛋白峰各管酶活。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白質濃度的測定

依據 Bradford 法[5］。

1.3.2 蛋白質相對分子質量的測定及酶純度鑒定[6］

SDS-PAGE條件:濃縮膠4%、分離膠10%，染色劑:Coomassie brilliant blue R-250。

1.3.3 α-半乳糖苷酶活的測定

pNPGal(4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷)法:5mmoi/L pNPGal溶液 0.2 mL、pH 4.5、100 mmol/L NaAc-HAc緩沖液和適量酶液0.8 mL，設定溫度下反應4 min，2 mL Na2CO3(2%)終止反應，以 Na2CO3滅活酶液作對照，400 nm處比色。酶活單位:每1 min產生1μmol對硝基苯所需酶量為1IU。

DNS(3，5-二硝基水楊酸)法:1%蜜二糖(棉子糖)溶液 0.3 mL，pH4.0、100 mmol/L NaAc-HAc緩沖液和適量酶液0.7 mL，一定溫度下準確反應12 h;加入DNS試劑1.0 mL終止反應，沸水浴顯色5 min，流水速冷，適當稀釋并測定482 nm(反應產物經波長掃描所得)處光吸收值，以DNS試劑滅活酶液作對照。酶活力單位:每1h產生2μmol(1μmol)葡萄糖還原當量所需酶量為1U。

1.3.4 酶的最適反應溫度及熱穩定性的測定

在不同溫度下以pNPGal法測定酶活，以酶活最高時的反應溫度為最適反應溫度;酶液在不同溫度下分別保溫20 min、40 min和90 min后測定殘余酶活，以未保溫酶液的酶活為100%，比較不同溫度下酶活的半衰期。

1.3.5 酶的最適反應pH及pH穩定性的測定

在不同pH的緩沖液中按照pNPGal法測定酶活，以酶活最高時的反應pH為最適反應pH;將酶液用不同pH的緩沖液同等倍數稀釋，25℃保溫12h，依pNPGal法測定殘余酶活。

1.3.6 無機離子對酶活的影響

在含5 mmol/L待考察離子的酶促反應體系中以pNPGal為底物測定酶活，以去離子水透析的酶液的酶活為100%。

1.3.7 酶促動力學參數的測定

酶液在 55℃、pH 4.5、100 mmol/L NaAc-HAc 緩沖液中與不同濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L)pNPGal反應，測定酶活并用Excel 2007對測定數值進行非線性擬合，求出酶水解底物的Km、Vmax，測定酶蛋白量計算kcat。

1.4 數據分析

采用統計軟件DPS v3.01專業版，SSR檢驗顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 根霉A01胞內α-半乳糖苷酶的分離與純化

超聲破碎菌絲體細胞后所得粗酶液依次經過三相分離和凝膠過濾，αGAL-R2被純化了54.8倍、酶活收率為27.3%(表1)，達到了電泳純(圖1)。凝膠色譜圖上顯示2個蛋白峰，保留時間短的蛋白峰為αGAL-R2活性峰，并且在SDS-PAGE圖譜上顯示單一條帶(圖1)，相對分子質量為85.6。依據相同凝膠色譜條件下蛋白質的保留時間與相對分子質量的關系(數據未列)推知，αGAL-R2分子是由85.6 ku的亞基構成的四聚體，分子質量約為302ku。

圖1 α-半乳糖苷酶的凝膠色譜和SDS-PAGE圖譜

表1

2.2 根霉A01胞內α-半乳糖苷酶的酶學性質

2.2.1 pH值對α-半乳糖苷酶活性及穩定性的影響

在pH值4.0～6.0的范圍內，αGAL-R2對pNPGal均有明顯的水解活性(圖2)，其中pH值為4.5時，酶的水解活性最高;酶活性隨pH變化而下降，pH值由4.0下降至3.0時，相對酶活由78.3%下降到2.1%，而pH值由5.5上升至7.0時，相對酶活由83.6%下降到30%，說明在較低的pH范圍內，酶活性對酸度的變化更明顯。在25℃、pH值4.0～8.2的范圍內，αGAL-R2的活性近乎完全保留(圖2)，但在pH＜4.0時殘余酶活迅速下降，說明該酶對酸的耐受性差。

圖2 pH對α-半乳糖苷酶活性及穩定性的影響

2.2.2 溫度對α-半乳糖苷酶活性及穩定性的影響

以pNPGal為底物研究了溫度對αGAL-R2活性和穩定性的影響(圖3)。αGAL-R2在30～65℃均有水解活性，30～55℃酶活性隨溫度上升而線性增加至最大值，最適作用溫度為55℃，但反應溫度高于60℃時，酶活性急劇下降，65℃時的反應活性與30℃時的活性相當，只達到最大酶活的32%。αGAL-R2在50℃保溫90 min，酶活保留了48%，而在55℃保溫20 min，酶活僅保留了12%，因此，αGAL-R2在50℃有較好的熱穩定性。

圖3 溫度對α-半乳糖苷酶活性和穩定性的影響

2.2.3 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

αGAL-R2水解pNPGal的活性受金屬離子的影響(表2)。被試離子(5 mmol/L)中 K+、Zn2+、Ca2+等離子對酶活性無顯著影響;Fe2+和Fe3+對酶活性具有顯著的激活作用，Fe2+存在時，相對酶活達到256.8% ±5.9%;但 Mn2+、Cu2+、Hg+和 Mg2+等離子強烈抑制酶活性，而Ba2+的抑制作用較弱。

表2 金屬離子對α-半乳糖苷酶活性的影響

2.2.4 α-半乳糖苷酶的底物特異性及催化效率

在pH 4.5、55℃的反應條件下，αGAL-R2水解pNPGal的動力學常數分別為:Km=(0.242±0.027)mmol/L，Vmax=(19.344 ± 0.246)IU/mgPr，kcat=(110.39 ±1.404)s-1，kcat/Km=4.089×105L/(mol·s);在pH4.5、40℃時αGAL-R2能水解蜜二糖、棉子糖，水 解 速 度 依 次 為 138.3μmol/(h· mg)、19.7μmol/(h·mg)。因此，αGAL-R2能高效催化pNPGal的水解，而對蜜二糖、棉子糖的水解能力相對較弱。

3 討論

圍繞適用于豆類食品和飼料加工的α-半乳糖苷酶，多種微生物源αGAL得到了研究，它們的酶學性質和分子特性因菌種、菌株不同而有較大差異。一般細菌分泌的αGAL的最適反應pH值在5.0～7.5，最適反應溫度在 37～40℃[1］，但 Rhodothermus marinus[7］的最適溫度為 85℃;絲狀真菌及酵母分泌的αGAL的最適反應pH在4.5～8.0，最適溫度在50～60℃[1］。αGAL 的 pH 穩 定 范 圍 多 在 pH5.0～9.0[3，7-9］，熱穩定范圍常小于 60℃[1］，也有 Absidia sp.[11］，Penicillium sp.[12］和 Aspergillus terreus GR[10］等菌株達到 65℃，Rhodothermus marinus[7］達到 75℃。產自細菌的αGAL常由同種亞基形成多聚體蛋白[1］如Bifidobacterium bifidum(表觀分子相對質量243、亞基85 ku)[13］、Bifidobacterium breve(同二聚體、表觀分子相對質量 160)[14］、Rhodothermus marinus(表觀分子相對質量 200、亞基 50 ku)[7］，部分真菌源 αGAL也形成多聚體，如源于 Rhizopus sp.、Gibberella sp.(亞基相對分子質量 82.0、82.9)[1］。依據 αGAL-R2 的凝膠色譜保留值和SDS-PAGE圖譜推知，αGAL-R2是由相對分子質量為85.6的亞基構成的四聚體，分子構成類似于源于Rhodothermus marinus的αGAL。

αGAL-R2在反應溫度 40～60℃、pH 4.0～6.0顯示較高酶活性，最適反應溫度為55℃、最適反應pH 為4.5，與源于Aspergillus oryzae的 αGAL(pH4.8、50℃)[16］相近。αGAL-R2 在 pH4.0～8.9 的范圍內25℃保溫12 h，酶活性近乎完全保留，pH 3.0時酶活幾乎完全喪失;在50℃保溫1h，酶活保留了48%，而55℃保溫20 min時，酶活只保留了12%，由此可知，該酶的熱穩定性較差，但該酶的酸熱穩定性仍在已有文獻報道的范圍內。

αGAL-R2對pNPGal、蜜二糖、棉子糖都能水解，水解pNPGal的能力最強，其Km值與源于Aspergillus terreus GR[10］、Rhizopus sp.F78[1］的 αGAL 近似，但催化效率kcat/Km遠大于前兩者，是一種高比活αGAL。αGAL催化pNPGal水解的活性常受金屬離子的抑制，Cu2+、Fe2+、Mn2+、Hg+等常強烈抑制酶活性，而Na+、K+、Ca2+、Mg2+等 常 對 酶 活 性 抑 制 較弱[1，3，9-10，17］，但是 αGAL-R3 水解的活性卻受 Fe2+、Fe3+的激活，其中Fe2+的激活作用最為顯著，受Mg2+的顯著抑制。許多αGAL對蜜二糖、棉子糖的水解活性很弱，常需要在酶活測定條件下反應24h方能檢測到反應產物[1］，αGAL-R2水解蜜二糖、棉子糖的活性也較弱，但水解活性較其他來源的αGAL強，反應12h即可檢測到反應產物，反應速度分別為138.3μmol/(h·mg)、19.7μmol/(h·mg)。因此，實驗菌株根霉A01發酵豆渣能有效去除其中的蜜二糖、棉子糖等物質，該菌株在發酵法消除食品和飼料中的脹氣因子方面具有較大的實際應用價值，同時αGAL-R2的高比活性不僅有利于提高該酶的異源表達效率，而且也能為αGAL分子的遺傳改造提供實驗材料。

[1]劉傳富，董海洲，張瑞霞，等.擠壓膨化豆渣理化性質的研究[J］.中國糧油學報，2009，24(2):56-58.

[2］ 王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M］.北京:高等教育出版社，2002:39.

[3]曹雅男.微生物來源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆與性質研究[D］.北京:中國農業科學院博士學位論文，2008.

[4]王璇琳，李素波，章揚培.重組α-半乳糖苷酶消除大豆低聚糖引起的小鼠腸胃脹氣的研究[J］.營養學報，2006，28(5):434-437

[5]李建武，袁明秀.生物化學實驗原理和方法[M］.北京:北京大學出版社，2000:89-130.

[6］ 郭堯君.蛋自質電泳實驗技術[M］.北京:科學出版社，2001:161-191.

[7]Blücher A，Karlsson E N，Holst O.Substrate-dependent production and some properties of a thermostable，α-galactosidase from Rhodothermus marinus[J］.Biotechnology Letters，2000，22(8):663-669.

[8]Ibrahim SA，Alazzeh AY，Awaisheh SS，et al.Enhancement of α-and β-Galactosidase activity in Lactobacillus reuteri by different metal ions[J］.Biological Trace Element Research，2010，136(1):106-116.

[9]劉彩琴，何國慶.臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的分離純化及酶學性質[J］.中國食品學報，2009，9(4):70-75.

[10]Shankar S K，Dhananjay S K，Mulimani V H.Purification and characterization of thermostable α-galactosidase from Aspergillus terreus GR[J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，152(2):275-285.

[11]Li H，Liang W Q，Wang Z Y，et al.Enhanced production and partial characterization of thermostable α-galactosidase by thermotolerant Absidia sp.WL511 in solid-state fermentation using response surface methodology[J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，22(1):1-7.

[12]李孝輝，竺莉紅，吳吉安，等.青霉α-半乳糖苷酶的純化及酶學特征的研究[J］.浙江農業學報，2003，15(2):99-102.

[13]Goulas T，Goulas A，Tzortzis G，et al.A novel α-galactosidase from Βifidobacterium bifidum with transgalactosylating properties:gene molecular cloning and heterologous expression[J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，82(3):471-477.

[14]Xiao M，Tanaka K，Qian X M，et al.High-yield production and characterization of α-galactosidase from Bifidobacterium breve grown on raffinose[J］.Biotechnology Letters，2000，22(9):747-751.

[15]Herder I F，Rosell A M M，Zuilen C M，et al.Cloning and expression of a member of the Aspergillus niger gene family encoding α-galactosidase[J］.Molecular and General Genetics MGG，1992，233(3):404-410.

[16]Girigowda K，Mulimani V H.Hydrolysis of galacto-oligosaccharides in soymilk by κ-carrageenan-entrapped α-galactosidase from Aspergillus oryzae[J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，22(5):437-442.

[17]Ferreira J G，Reis A P，Guimartes V M，et al.Purification and characterization of Aspergillus terreus α-galactosidases and their use for hydrolysis of soymilk oligosaccharides[J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，Online FirstTM，18 February 2011.

[18]許堯興，李艷麗，柳永，等.黑曲霉變種RM48α-半乳糖苷酶的分離純化及其酶學性質研究[J］.浙江大學學報:農業與生命科學版，2009，35(2):147-152.

ABSTRACTUsing three-phase partitioning followed by filtration chromatography with Sephadex G-100，an intracellular α-galactosidase from Rhizopus sp.A01 grown on soya bean dregs broth was purified to homogeneity with a 54.8-fold increase in specific activity and 27.3%recovery.The relative molecular weight of the enzyme was about 302 ku through gel filtration and 85.6 ku through SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，suggesting that the native enzyme was a tetramer.The α-galactosidase showed high activity against p-nitrophenyl-α-d-galactopyranoside(pNPGal)but had little activity for melibiose and raffinose，and the optimal activity was observed at pH 4.5 and 55℃.The kinetic parameters of Kmand kcat/Kmwere 0.242 ±0.027 mmol/L and 4.089×105L/(mol·s)with pNPGal，and the rates of hydrolysis for melibiose and raffinose were 138.3 μmol/(h·mg)and 19.7 μmol/(h·mg)，respectively.The enzyme activity was significantly activated by Fe2+and Fe3+，but strongly inhibited by Mn2+，Cu2+，Hg+and Mg2+at 5.0 mmol/L.The α-galactosidase was highly stable over pH range from 4.0 to 8.2 at 25℃，and it retained approximately 48%of the original activity after incubation for 90min at 50℃.

Key wordsraffinose，melibiose，α-galactosidase，three-phase partitioning

Purification and Characterization of Intracellular α-galactosidase from Rhizopus sp.A01

Wang Jian-feng1，Chen Jin-zhao2，Li Jiang1，Rao Jun1
1(Department of Biology，East China Institute of Technology，Fuzhou 344000，China)
2(College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China)

碩士，講師。

2011-10-19，改回日期:2012-04-03