低氧聯合NaCl脅迫下蠶豆發芽富集γ-氨基丁酸培養條件優化*

楊潤強，陳惠，顧振新

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京，210095)

低氧聯合NaCl脅迫下蠶豆發芽富集γ-氨基丁酸培養條件優化*

楊潤強，陳惠，顧振新

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京，210095)

以蠶豆(啟豆2號)為原料，研究了低氧聯合NaCl脅迫下培養條件對γ-氨基丁酸(GABA)富集的影響。結果顯示:非脅迫培養時間、培養pH和脅迫培養時間顯著影響發芽蠶豆GABA積累。蠶豆發芽富集GABA最佳培養條件是非脅迫培養1.5 d、培養液pH 3.5和低氧聯合NaCl脅迫4 d，在此條件下其GABA含量可達1.06 mg/g DW，為原料蠶豆的7.57倍。

蠶豆，發芽，γ-氨基丁酸，富集，低氧脅迫，NaCl脅迫

蠶豆富含蛋白質、淀粉、氨基酸、維生素和礦物質等，是人體良好的營養來源。發芽是改善豆類種子營養成分和降低抗營養因子的有效方法。發芽能提高豆類生理活性物質的含量，如發芽可提高蠶豆中 L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)和總酚[1］，尤其 γ-氨基丁酸(GABA)含量[2］。GABA是一種非蛋白質氨基酸，具有降血壓、降血脂等生理功能。植物在熱擊、冷害、機械損傷、鹽脅迫和低氧等逆境脅迫條件下，均能強烈激活谷氨酸脫羧酶(GAD)和二胺氧化酶(DAO)活性，促進GABA的合成[3］。低氧脅迫下，植物細胞中H+濃度提高，導致細胞質酸化，為GABA的合成提供了條件[4］。鹽脅迫可使細胞中Ca2+濃度升高，促使鈣調蛋白(CaM)表達水平提高，GAD被 Ca2+/CaM激活，從而促進 GABA積累[5］。本文采用低氧聯合NaCl脅迫的方式處理發芽蠶豆，探討了培養條件對蠶豆發芽富集GABA的影響。通過正交試驗對培養時間、pH和脅迫時間進行優化，確定最佳培養條件，為開發功能性蠶豆食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠶豆品種:啟豆2號，購自江蘇沿江地區農業科學研究所。蠶豆種子于2011年收獲后密閉保存于4℃下聚乙烯容器中，備用。

1.2 種子培養

稱取一定量蠶豆，用蒸餾水清洗后，1%的次氯酸鈉消毒30 min，蒸餾水洗凈殘留的次氯酸鈉。于蒸餾水中30℃浸泡8 h，取出吸干表面水分，置于鋪有2層紗布的托盤(長、寬、高分別為20 cm、15 cm和5 cm)中，上面覆蓋2層濕紗布，于33±1℃避光培養。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗

非脅迫培養:取30±2 g經8 h浸泡處理的蠶豆，置于鋪有2層紗布的托盤(長、寬、高分別為20 cm、15 cm和5 cm)中，上面覆蓋2層濕紗布，分別避光培養0、0.5、1、1.5、2、2.5 和3d 后，測定 GABA 含量。

pH:取30±2 g經前期培養的蠶豆，置于具塞培養瓶中，加入 pH 值分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和 6.5 的 60 mmol/L NaCl溶液 250 mL，參考 Li等[6］的方法[(33 ±1)℃，通氣量為 1.2 L/min］避光培養4 d。

脅迫培養:取30±2 g置于具塞培養瓶中，加入含有60 mmol/L的NaCl溶液的檸檬酸緩沖液(pH 3.5)，于(33 ±1)℃下低氧脅迫 0、1、2、3、4、5 和6d。

1.3.2 復因素試驗

以培養時間、脅迫時間和pH為3個影響因素，各取3水平，進行L9(34)正交試驗，研究發芽蠶豆中GABA含量變化，試驗設計與結果見表。

游離氨基酸:采用水合茚三酮顯色法測定[8］。

1.4 GABA含量測定

1.4.1 GABA提取和樣液制備

稱取1.0 g鮮重的發芽蠶豆于研缽，加5 mL 7%的乙酸研磨成漿。按照Bai等[7］的方法對樣品進行純化。漿液靜置提取1 h，6000 r/min離心15 min取上清液，加入5 ml無水乙醇，在0～4℃放置2 h，以沉淀多糖和雜蛋白;之后6000 r/min離心20 min。上清液在0.1 MPa，45℃條件下真空干燥，殘余物溶于2 mL1M NaHCO3(pH 9.0)緩沖溶液，4000 r/min離心10 min，上清液備用。

1.4.2 測定方法

GABA測定采用高壓液相色譜HPLC(Agilent 1200，USA)，色譜柱為 ZORBAX Eclipse AAA reversed-phase column(3.5 μm)，4.6×150 mm，條件參照Yang等[8］的方法。取1 mL(pH 9.0)氨基酸溶液，加入2 mg/mL的二甲氨基苯磺酰氯的丙酮溶液1 mL，于67℃ 保溫10 min后用冰浴終止反應，然后使用DAD檢測器于425 nm紫外檢測。流動相A為乙睛，流動相B為0.045 M CH3COONa(pH 4)緩沖液，上樣量為20 μL，流速為1 mL/min，分離時間30 min，柱度30℃。

1.5 數據統計與分析

試驗設3次重復，結果換算成干基重，以平均值±SD表示，數據采用SPSS(18.0)軟件處理，設置顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 培養條件對發芽蠶豆富集GABA的影響

2.1.1 培養時間

如圖1所示，隨非脅迫培養時間的延長，蠶豆中GABA含量呈先增加后減少的趨勢，培養1.5 d時，發芽蠶豆中GABA含量達到最大值(1.02 mg/g DW)，為0 d的3.43倍。因此，選擇培養時間1.5 d為后續試驗的非脅迫培養時間。

圖1 培養時間對發芽蠶豆GABA含量的影響

2.1.2 培養液pH值

由圖2可知，隨著發芽蠶豆培養液pH值的升高，GABA含量呈先下降后上升的變化趨勢。培養液pH值為3.0時，蠶豆GABA含量最高;但由于此pH條件下蠶豆發芽率很低，蠶豆生命活動很弱，從而容易腐爛或有異味。因此，選擇pH值3.5作為后續試驗緩沖液pH值。

圖2 pH對發芽蠶豆GABA含量的影響

2.1.3 脅迫時間

脅迫時間對GABA含量的影響見圖3。GABA含量隨脅迫時間的延長先逐漸增加后趨于平衡。當脅迫4 d時，GABA含量達到最大值(1.02 mg/g DW)，此后，其含量趨于平衡。因此，選擇4 d為后續試驗所需的脅迫時間。

圖3 脅迫時間對發芽蠶豆GABA含量的影響

2.2 培養條件優化

選取單因素試驗得到的發芽蠶豆富集GABA最佳培養時間、培養pH和脅迫時間為中間值，以培養時間(0.5 d、1.5 d和 2.5 d)、培養 pH(3.5、4.0 和4.5)和脅迫時間(2 d、4 d和6 d)進行3因素3水平正交試驗，實驗結果見表1。

表1極差分析結果表明，各因素對發芽蠶豆中GABA含量影響的主次順序為C、A、B，即培養脅迫時間＞培養時間＞pH。比較各水平的K值可知，發芽蠶豆富集GABA的最佳培養條件為A2B1C2，即培養時間1.5 d、培養pH 3.5和脅迫時間4 d(表中第4組)。

表1 L9(34)正交實驗結果

3 討論

植物受到低氧、冷激、干旱、鹽脅迫和機械傷害等逆境脅迫時，體內GABA含量顯著增加[9］，其中低氧和鹽脅迫是富集GABA最安全有效的方法。但由于低氧和鹽脅迫均為逆境，若直接將植物種子置于其中，勢必長勢不佳，因此最有效的方法是先將植物種子正常培養一段時間，之后置于低氧和鹽脅迫等逆境中進行脅迫培養。因此，本研究采用此培養方法研究低氧聯合NaCl脅迫下培養條件對蠶豆GABA富集的影響。

植物中GAD的最適反應pH值通常在5.5～6.0之間[10］，說明植物體內GAD在微酸性環境下活性高。Carroll等[11］研究表明，酸性環境激活了胡蘿卜細胞的GAD活性，導致GABA積累，當胞質pH恢復正常后GAD活性降低。Crawford等[12］研究發現，外源加入透膜性弱酸15 s后，蘆筍葉肉細胞出現GABA的積累。這些實驗為植物細胞質pH值變化影響GABA合成提供了證據。由于植物體內L-Glu脫羧，造成反應體系pH升高，偏離了GAD的最適pH，使GABA富集速度下降。將反應置于緩沖體系中，可以穩定反應的pH值，提高GABA產量。白青云[13］研究表明，緩沖液類型影響GABA富集，檸檬酸緩沖液培養的粟谷生長情況良好，而醋酸緩沖液粟谷芽生長受到抑制。粟谷富集GABA的最適pH值為5.8，與GAD的最適pH值相近。李巖[6］則采用pH 3.19的檸檬酸-磷酸緩沖液富集蠶豆GABA。本研究選擇更安全可靠的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進行GABA的富集研究。結果表明，培養pH 3.5時，蠶豆生長良好，GABA的富集量達到1.02 mg/g DW。此pH值明顯低于大豆(pH 4.1)[14］、糙米(pH 5.6)[15］和粟谷(pH 5.8)[16］。這是由于蠶豆子葉厚實、籽粒較大，因此外界環境中pH值必須足夠低才能維持體內低pH條件。

4 結論

低氧聯合NaCl脅迫下，培養時間、培養pH和脅迫時間顯著影響發芽蠶豆GABA積累，并且三者對GABA含量影響的順序是:培養pH＞培養時間＞脅迫時間。

[1]Randhir R，Shetty P，Shetty K.L-DOPA and total phenolic stimulation in dark germinated fava bean in response to peptide and phytochemical elicitors[J］.Process Biochemistry，2002，37(11):1247-1256.

[2]Martinez-Villaluenga C，Kuo Y H，Lambein F，et al.Kinetics of free protein amino acids，free non-protein amino acids and trigonelline in soybean(Glycine max L.)and lupin(Lupinus angustifolius L.)sprouts[J］.European Food Research and Technology，2006，224(2):177-186.

[3]Xing S G，Jun Y B，Hau Z W，et al.Higher accumulation of gamma-aminobutyric acid induced by salt stress through stimulating the activity of diarnine oxidases in Glycine max(L.)Merr.roots[J］.Plant Physiology and Biochemistry，2007，45(8):560-566.

[4]Perata P，Vernieri P，Armellini D，et al.Immunological detection of acetaldehyde-protein adducts in ethanol-treated carrot cells[J］.Plant Physiology，1992，98(3):913-918.

[5]Kinnersley A M，Turano F J.Gamma aminobutyric acid(GABA)and plant responses to stress[J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19(6):479-509.

[6]Li Y，Bai Q，Jin X，Wen H，et al.Effects of cultivar and culture conditions on γ-aminobutyric acid accumulation in germinated fava beans(Vicia faba L.)[J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90(1):52-57.

[7]Bai Q，Fan G，Gu Z，et al.Effects of culture conditions on gamma-aminobutyric acid accumulation during germination of foxtail millet(Setaria italica L.)[J］.European Food Research and Technology，2008，228(2):169-175.

[8]YangR，Chen H，Gu Z.Factors influencing diamine oxidase activity and γ-aminobutyric acid content of fava bean(Vicia faba L.)during germination[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(21):11616-11620.

[9]Kramer D，Breitenstein B，Kleinwaechter M，et al.Stress metabolism in green coffee beans(Coffea arabica L.):expression of dehydrins and accumulation of GABA during drying[J］.Plant and Cell Physiology，2010，51(4):546-553.

[10]Johnson B S，Singh N K，Cherry J H，et al.Purification and characterization of glutamate decarboxylase from cowpea[J］.Phytochemistry，1997，46(1):39-44.

[11]Carroll A D，Fox G G，Laurie S，et al.Ammonium assimilation and the role of[gamma］-aminobutyric acid in pH homeostasis in carrot cell suspensions [J］.Plant Physiology，1994，106(2):513-520.

[12]Crawford L A，Bown A W，Breitkreuz K E，et al.The synthesis of gamma-aminobutyric acid in response to treatments reducing cytosolic pH [J］.Plant Physiology，1994，104(3):865-871.

[13]白青云.低氧脅迫和鹽脅迫下發芽粟谷 γ-氨基丁酸富集機理及抗氧化性研究[D］.南京:南京農業大學，2009.

[14]Y Guo，Chen H，Song Y，et al.Effects of soaking and aeration treatment on γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean(Glycine max L.)[J］.European Food Research and Technology，2011，232787-795.

[15]鄭藝梅.發芽糙米營養特性，γ-氨基丁酸富集及生理功效的研究[D］.武漢:華中農業大學，2006.

[16]Bai Q Y，Chai M Q，Gu Z X，et al.Effects of components in culture medium on glutamate decarboxylase activity and gamma-aminobutyric acid accumulation in foxtail millet(Setaria italica L.)during germination[J］.Food Chemistry，2009，116(1):152-157.

ABSTRACTThe culture condition of γ-aminobutyric acid accumulation in germinating fava bean(Qi Bean 2)seeds under hypoxia combined with NaCl was investigated.The results showed that non-stress culture time，pH and stress time impacted the accumulation of GABA significantly.The optimum condition was culturing for 1.5 days，pH 3.5 and stress for4days.The GABA content was 1.06 mg/g DW and was 7.57-fold of that in un-germinated fava bean.

Key wordsFava bean，germination，γ-aminobutyric acid，accumulation，hypoxia stress，NaCl stress

The Optimization of Culture Condition on γ-aminobutyric Acid Accumulation in Fava Bean(Vicia faba L.)Under Hypoxia Combined with NaCl

Yang Run-qiang，Chen Hui，Gu Zhen-xin
(Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

博士研究生(顧振新教授為通訊作者，E-mail:yuzx@njau.edu.cn)。

*國家自然科學基金(31071581);中央高校科研業務費專項基金(KYZ200917);江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)

2012-03-21，改回日期:2012-05-04