離子交換法純化氨基葡萄糖*

梁芳，劉龍，李江華，2，華兆哲，2，堵國成，2，陳堅，3

1(江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

離子交換法純化氨基葡萄糖*

梁芳1，劉龍1，李江華1，2，華兆哲1，2，堵國成1，2，陳堅1，3

1(江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

以重組大腸桿菌的發酵液為原料，用離子交換法分離提取發酵液中的氨基葡萄糖。研究了陽離子交換樹脂001×8吸附氨基葡萄糖的影響因素和動力學性質。確定最優工藝條件為:緩沖液pH=2.2，溫度30℃，洗脫液0.7 mol/L的硫酸銨溶液。層析柱Ф1 cm×10 cm，填料6 mL，進樣量192 mL，進樣流速3.19 BV/h(即每小時流過樣品的體積為填充樹脂床容積的3.19倍)，洗脫流速3.8 BV/h，在此工藝條件下，吸附率達到95%，洗脫率達到98.35%。

氨基葡萄糖，離子交換，分離，洗脫

氨基葡萄糖(glucosamine，2-deoxy-D-glucose，GlcN)是葡萄糖的一個羥基被氨基取代的化合物，是一種重要的功能單糖。氨基葡萄糖及其衍生物廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等領域，尤其是因為氨基葡萄糖硫酸鹽有緩解關節炎患者的疼痛作用而越來越受到人們的重視。

本研究采用離子交換法從發酵液中提取氨基葡萄糖，發酵液來自本研究室構建的重組大腸桿菌(E.coli-glms-gna1)發酵48 h的發酵液。選擇苯乙烯系強酸性陽離子交換樹脂001×8純化氨基葡萄糖的主要依據是氨基葡萄糖是葡萄糖的一個羥基被氨基取代的化合物，苯乙烯系強酸性陽離子交換樹脂攜帶可移動的活性基團，當該樹脂侵泡在含有氨基葡萄糖的發酵液中時，氨基葡萄糖擴散到離子交換樹脂的表面，然后進入樹脂內部，與樹脂的活性基團相交換，被交換出來的活性基團逐漸擴散到發酵液中，完成樹脂對氨基葡萄糖的吸附過程。氨基葡萄糖被樹脂吸附后，高濃度的鹽溶液通過競爭作用把樹脂上吸附的氨基葡萄糖置換下來，洗脫液再經過結晶、濃縮可以得到氨基葡萄糖純品。離子交換法從發酵液中提取純化氨基葡萄糖要比傳統化學方法大大降低生產成本且產品純度較高。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

發酵液:來自本研究室構建的重組大腸桿菌(E.coli-glms-gna1)的發酵液。

E.coli-glms-gna1:本實驗室保藏，將來自大腸桿菌E.coli基因組的氨基葡萄糖合成氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)通過pET-28(a)在E.coli ATCC 25947(DE3)中進行了克隆和表達而獲得。

發酵培養基配方:(1)蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、MnCl2·4H2O 15 mg/L;(2)緩沖液 KH2PO42.31 g/L、K2HPO412.54 g/L;(3)葡萄糖 100 g/L;④乳糖10 g/L。

發酵條件:3 L發酵罐，培養溫度30℃，攪拌轉速400 r/min，1.5 vvm，培養周期24 h。

001×7，001×8，001×10和 ZGSPC106ca四種型號的樹脂均購買于浙江爭光實業股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

5804R高速冷凍離心機(EPPENDORF);UV2450紫外分光光度計(SHIMADZU);核酸蛋白純化系統:HD-A電腦采集器，CHL-ZD定時數顯恒流泵，HD-3紫外檢測儀，BS-100A自動部份收集器(上海青浦滬西儀器廠);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);HYG-IIa回轉式恒溫調控搖瓶柜(上海欣蕊自動化設備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預處理

稱取一定質量的樹脂于三角瓶中，用去離子水浸泡12 h后，反復洗滌樹脂，直至出水清晰、無異味、無細碎樹脂為止;再用約2倍樹脂體積的4%的HCl溶液浸泡樹脂4 h，傾出酸液，用去離子水洗至出水呈中性;然后用約2倍樹脂體積的4%左右的NaOH溶液浸泡樹脂4 h左右，傾出堿液，用去離子水洗至出水呈中性;再用約2倍樹脂體積的4%的HCl溶液浸泡樹脂4 h，用去離子水洗至出水呈中性。預處理好的樹脂貯存備用。

1.3.2 發酵液預處理

用離心機離心后去除菌體，收集上清液。由于發酵液中除了氨基葡萄糖之外，還有相當多的N-乙酰氨基葡萄糖，為了使N-乙酰氨基葡萄糖脫去乙酰基，在發酵液中加入0.1 mol/L的HCl，100℃水浴3 h。氨基葡萄糖的轉換完成后將發酵液冷卻，由于發酵液中還含有色素，按照100∶4(質量比)加入硅藻土充分吸附后過濾。預處理好的氨基葡萄糖放于4℃冰箱保存待用。

1.3.3 樹脂的選擇

取預處理好的001×7，001×8，001×10和 ZGSPC106ca四種型號的樹脂各2 g于100 mL三角瓶中，各加入10 mL處理好的發酵液，封好后放于37℃，180 r/min搖床上，振蕩6 h后從搖床上取下，測上清液中的氨基葡萄糖含量，對比各個型號樹脂的吸附率，選擇一種較為合適的樹脂。

1.3.4 樹脂靜態交換容量和吸附率的測定

式中，Qe為樹脂交換容量，mg/mL樹脂;C0為發酵液中氨基葡萄糖初始濃度，g/L;Ce為吸附平衡時氨基葡萄糖濃度，g/L;V為發酵液初始體積，mL;VR為濕樹脂體積，mL;E為樹脂吸附率。

1.3.5 最適緩沖液的確定

選用苯乙烯系強酸性陽離子樹脂001×8吸附氨基葡萄糖，靜態試驗確定樹脂吸附氨基葡萄糖的緩沖液的最適pH。

1.3.5.1 緩沖液傾出法

配制pH值從2到8共12個梯度的緩沖液，取預處理好的樹脂2 g于15 mL離心管中，用緩沖液充分平衡后傾去緩沖液，加入預處理好的發酵液4 mL。放在37℃，160 r/min的搖床上充分振搖約12 h。取出靜置30 min。測定上清液中氨糖的含量。

1.3.5.2 緩沖液未傾出法

配制pH值從2.2到8共7個梯度，取預處理好的樹脂1 g于15 mL離心管中，加入10 mL緩沖液平衡樹脂后加入預處理好的發酵液2 mL。放在37℃，160 r/min的搖床上充分振搖約16 h。取出靜置30 min。測定上清液中氨糖的含量。

1.3.6 吸附飽和曲線的確定

把用最適緩沖液平衡后的樹脂2 g加入100 mL的三角瓶中，加入35 mL的發酵液，放在180 r/min的搖床上，間隔取樣，測其中的氨糖濃度。

1.3.7 氨糖濃度和吸附溫度的影響

1.3.7.1 氨糖濃度

配制10，20，30 g/L和40 g/L的氨基葡萄糖溶液，取預處理好的001×8樹脂1 g于100 mL三角瓶中，各加入不同濃度的氨基葡萄糖溶液50 mL，封好后放于200 r/min，37℃搖床，振搖11 h后取下，比較每個三角瓶中樹脂的吸附率，確定樹脂吸附的最佳氨基葡萄糖濃度。

1.3.7.2 溫度

取1 g樹脂于100 mL三角瓶中，加入30 mL發酵液，分別在(1)28℃，200 r/min;(2)30℃，200 r/min;(3)37℃，200 r/min的搖床上振搖4 h后取下，比較不同溫度下的吸附率，選擇合適的吸附溫度。

1.3.8 洗脫液的選擇

方法:分別配置 0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 mol/L的硫酸銨溶液。吸附飽和的樹脂，用蒸餾水充分洗滌后，取1 g加入100 mL三角瓶中，再加入25 mL洗脫液。放于37℃，180 r/min搖床上振搖24 h后取下，靜置約13 h，測洗脫液中的氨糖含量，計算解析率。

1.3.9 動態吸附實驗的穿透曲線

樹脂柱型號為1 cm×10 cm，裝預處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進樣，流速為3.19 BV/h，間隔取樣并檢測，作樹脂在此條件下的吸附穿透曲線并利用沈金玉等建立的分析吸附穿透曲線的穿透函數法分析本研究離子交換過程的穿透曲線。求出吸附過程中的一些參數。該模型假設:(1)離子交換柱橫截面上濃度分布相等;(2)離子交換柱中所有交換區等長;(3)料液流動速度大于固相濃度波動速度;(4)料液以平推流形式運動而且沒有縱向液體擴散現象。

1.3.10 優化進樣流速和洗脫流速

1.3.10.1 優化進樣流速

固定樹脂柱型號為1 cm×10 cm，裝預處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，緩沖液流速3.19 BV/h，進樣流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進樣，其中:進樣量10 mL，洗脫流速1.60 BV/h，進樣流速分別控制1.60 BV/h，3.19 BV/h和4.79 BV/h。比較不同進樣流速下的吸附效果，確定最佳進樣流速。

1.3.10.2 優化洗脫流速

固定樹脂柱型號為1 cm×10 cm，裝預處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進樣，其中，進樣量為10 mL，進樣流速3.19 BV/h，洗脫流速分別為 1.60 BV/h ，3.19 BV/h，4.79 BV/h，6.37 BV/h，7.66 BV/h，比較不同洗脫流速下的洗脫效果，確定最佳洗脫流速。

2 結果與討論

2.1 樹脂的篩選

從圖1中可以看出，所選幾種樹脂的吸附效果相近，而相同條件下，苯乙烯系強酸性陽離子樹脂001×8的吸附率最高，可以達到86.56% ，所以，選擇該樹脂吸附純化氨基葡萄糖。苯乙烯系強酸性陽離子樹脂001×8是在交聯度為8%的苯乙烯-二乙烯苯共聚體上帶有磺酸基(—SO3H)的陽離子交換樹脂，有良好的交換容量和物理穩定性。

圖1 樹脂篩選結果圖

2.2 緩沖液的優化

2.2.1 緩沖液未傾出法

圖2 緩沖液未傾出法中不同pH值的緩沖液對吸附量和吸附率的影響

2.2.2 緩沖液傾出法

從圖1和圖2中可以看出，利用緩沖液傾出法和緩沖液未傾出法效果相同:吸附率隨緩沖液pH的變化而變化。pH值越低，吸附率越高，以pH=2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸作為緩沖液時，樹脂對氨基葡萄糖的吸附效果最好，吸附率可以達到80%以上。

圖3 緩沖液傾出法中不同pH值的緩沖液對吸附量和吸附率的影響

2.3 吸附飽和曲線的確定

從圖4可以看出，在第8 h樹脂對氨糖的吸附基本達到吸附平衡。離子交換基團在發酵溶液中解離后，能吸引發酵液中氨基葡萄糖的氨基，在8 h后，樹脂對氨基葡萄糖的吸附率達到43%，且隨著時間的增加，吸附率不再增加，說明8 h已經達到吸附平衡，再增加氨基葡萄糖的量樹脂也不會有吸附行為。

圖4001×8樹脂的吸附飽和曲線

2.4 氨基葡萄糖濃度和吸附溫度的優化

2.4.1 氨基葡萄糖濃度的優化

從圖5中可以看出，氨基葡萄糖濃度對吸附率的影響不大，當氨基葡萄糖濃度從10 g/L增加到40 g/L時，吸附率隨濃度增加有所提高，但提高幅度不是太大，考慮到節省成本和提高效率，可以取原發酵液直接進樣。

2.4.2 吸附溫度的優化

分析圖6，可以看出:001×8樹脂對氨基葡萄糖的吸附屬吸熱反應，溫度從28℃升高到37℃，吸附率逐漸提高。但溫度高于30℃時，吸附率的提高并不太明顯，為了節約成本，選擇30℃為樹脂吸附氨基葡萄糖的最佳溫度。

圖5 氨基葡萄糖濃度對吸附率的影響

圖6 溫度對吸附率的影響

2.5 洗脫液的優化

實驗中比較了 NaOH，NaCl，(NH4)2SO4和氨水的洗脫效果，結果發現(NH4)2SO4的洗脫效果最好。以下是對洗脫液(NH4)2SO4溶液濃度的優化結果。

圖7(NH4)2SO4溶液濃度對洗脫率的影響

從圖7可以看出:(NH4)2SO4溶液的濃度從0.3 mol/L增加到0.7 mol/L，吸附率隨著(NH4)2SO4濃度的增加而增加，當(NH4)2SO4濃度超過0.7 mol/L時，吸附率有所下降。即當硫酸銨溶液濃度為0.7 mol/L時，解析率最大，可達到80%以上，故選擇0.7 mol/L的(NH4)2SO4溶液為洗脫液。

2.6 動態吸附實驗的穿透曲線

發酵液持續的流過離子交換柱，剛開始流出液中的氨基葡萄糖濃度為零，隨著時間的增加，流出液中氨基葡萄糖的濃度逐漸上升，交換區不斷下移，當c=0.05 c0時(c為流出液中氨基葡萄糖的濃度，c0為原發酵液中氨基葡萄糖的濃度)，說明交換區已經移到離子交換柱的底部，對應的時間θ0為穿透時間，當c=0.95 c0時，柱內的全部樹脂已經達到飽和交換量，樹脂不再吸附氨基葡萄糖，以c/c0對時間t作圖，得到該條件下的穿透曲線(圖8)。

圖8 動態吸附過程的穿透曲線

從圖8中可以看出，該條件下的穿透時間θ0=9 min，192 min達到飽和，應停止進樣，最大進樣量為192 mL。

利用穿透函數法分析離子交換過程的穿透曲線。

圖9 穿透函數曲線

將穿透曲線用 Lg[1/(1-c/c0)］對(θ-θ0)在雙對數坐標上作圖，得到一條直線，說明穿透曲線符合穿透函數模型。依據該模型，可以求出樹脂吸附氨基葡萄糖的一些參數，在初始發酵液中氨基葡萄糖濃度c0=41.998 g/L，進樣表觀流速 U=1 mL/min，離子交換柱高度H=10 cm，柱子所裝填料等于6 g時，穿透函數曲線斜率β=0.014，穿透時間θ0=9 min，c/c0=0.632 時，傳質系數 Kf= β/θm=0.007 h-1，傳質單元高度Ht=6.714 m，交換區高度hz=9.302 cm，這些參數可以為實驗放大提供理論依據。

2.7 進樣流速和洗脫流速的優化

2.7.1 進樣流速的優化

圖10 進樣流速對洗脫率的影響

從圖10看出，進樣速度為1.6BV/h時，填料能夠更充分地吸附氨基葡萄糖，吸附率達到98.6%，隨著進樣流速的增加，吸附率下降，當進樣流速為4.79時，吸附率只有75.31%，由于進樣速度太小，會影響生產效率。從生產效率和洗脫率考慮，3.19 BV/h為最佳進樣速度，這時洗脫率可以達到95%以上。

2.7.2 洗脫流速的優化

用0.7 mol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫吸附了氨基葡萄糖的樹脂，洗脫流速過快，樹脂會因為不能被充分的洗滌導致洗脫率下降，洗脫速度過慢，會加長生產周期，并且可能發生二次吸附。從圖11看出:當洗脫流速為3.8 BV/h時，洗脫率最高，可以達到98.35%，選擇3.8 BV/h為洗脫流速。

圖11 洗脫流速對洗脫率的影響

3 結論

對氨基葡萄糖的下游提取工藝，包括發酵液的預處理以及樹脂對氨基葡萄糖的靜態吸附和動態吸附進行了研究。由于初始發酵液中含有較多的色素和一部分乙酰氨基葡萄糖，所以，要盡量的除去色素并將乙酰氨基葡萄糖水解為氨基葡萄糖。本研究以重組大腸桿菌的發酵液為原料，用離子交換法分離提取發酵液中的氨基葡萄糖。研究了陽離子交換樹脂001×8吸附氨基葡萄糖的影響因素和動力學性質。為氨基葡萄糖下游提取放大提供理論依據。

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ABSTRACTThe fermented broth of restructured E.coli as raw materials was used to extract glucosamine by ion exchange method.The effects of extraction conditions on glucosamine extraction were studied，and cation exchange resin 001 x 8 was selected.The affecting factors and dynamics properties of absorption of glucosamine by this resin were investigated.The optical conditions were:pH 2.2，temperature 30 ℃，elution with 0.7 mol/L of ammonium sulfate solution;Chromatography column Ф1cm x 10 cm，sample amount 192 mL，injection velocity 3.19 BV/h，elution velocity 3.8 BV/h .Under those conditions，adsorption rate reached to 95%and the elution rate was up to 98.35%.

Key wordsglucosamine，ion exchange，separation，elution

Study on Purification of Glucosamine by Ion Exchange

Liang Fang1，Liu Long1，Li Jiang-hua1，2，Hua Zhao-zhe1，2，Du Guo-cheng1，2，Chen Jian1，3
1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，
Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(劉龍副教授為通訊作者，E-mail:longliu@jiangnan.edu.cn)。

*國家自然科學基金重點項目(No.20836003)，國家重點基礎研究發展計劃(973項目)(No.2010CB535014)

2012-04-10，改回日期:2012-04-25