離子交換法純化氨基葡萄糖*

梁芳，劉龍，李江華，2，華兆哲，2，堵國(guó)成，2，陳堅(jiān)，3

1(江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

離子交換法純化氨基葡萄糖*

梁芳1，劉龍1，李江華1，2，華兆哲1，2，堵國(guó)成1，2，陳堅(jiān)1，3

1(江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

以重組大腸桿菌的發(fā)酵液為原料，用離子交換法分離提取發(fā)酵液中的氨基葡萄糖。研究了陽(yáng)離子交換樹脂001×8吸附氨基葡萄糖的影響因素和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。確定最優(yōu)工藝條件為:緩沖液pH=2.2，溫度30℃，洗脫液0.7 mol/L的硫酸銨溶液。層析柱Ф1 cm×10 cm，填料6 mL，進(jìn)樣量192 mL，進(jìn)樣流速3.19 BV/h(即每小時(shí)流過樣品的體積為填充樹脂床容積的3.19倍)，洗脫流速3.8 BV/h，在此工藝條件下，吸附率達(dá)到95%，洗脫率達(dá)到98.35%。

氨基葡萄糖，離子交換，分離，洗脫

氨基葡萄糖(glucosamine，2-deoxy-D-glucose，GlcN)是葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代的化合物，是一種重要的功能單糖。氨基葡萄糖及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，尤其是因?yàn)榘被咸烟橇蛩猁}有緩解關(guān)節(jié)炎患者的疼痛作用而越來(lái)越受到人們的重視。

本研究采用離子交換法從發(fā)酵液中提取氨基葡萄糖，發(fā)酵液來(lái)自本研究室構(gòu)建的重組大腸桿菌(E.coli-glms-gna1)發(fā)酵48 h的發(fā)酵液。選擇苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂001×8純化氨基葡萄糖的主要依據(jù)是氨基葡萄糖是葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代的化合物，苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂攜帶可移動(dòng)的活性基團(tuán)，當(dāng)該樹脂侵泡在含有氨基葡萄糖的發(fā)酵液中時(shí)，氨基葡萄糖擴(kuò)散到離子交換樹脂的表面，然后進(jìn)入樹脂內(nèi)部，與樹脂的活性基團(tuán)相交換，被交換出來(lái)的活性基團(tuán)逐漸擴(kuò)散到發(fā)酵液中，完成樹脂對(duì)氨基葡萄糖的吸附過程。氨基葡萄糖被樹脂吸附后，高濃度的鹽溶液通過競(jìng)爭(zhēng)作用把樹脂上吸附的氨基葡萄糖置換下來(lái)，洗脫液再經(jīng)過結(jié)晶、濃縮可以得到氨基葡萄糖純品。離子交換法從發(fā)酵液中提取純化氨基葡萄糖要比傳統(tǒng)化學(xué)方法大大降低生產(chǎn)成本且產(chǎn)品純度較高。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

發(fā)酵液:來(lái)自本研究室構(gòu)建的重組大腸桿菌(E.coli-glms-gna1)的發(fā)酵液。

E.coli-glms-gna1:本實(shí)驗(yàn)室保藏，將來(lái)自大腸桿菌E.coli基因組的氨基葡萄糖合成氨基葡萄糖乙酰化酶基因(gna1)通過pET-28(a)在E.coli ATCC 25947(DE3)中進(jìn)行了克隆和表達(dá)而獲得。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:(1)蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、MnCl2·4H2O 15 mg/L;(2)緩沖液 KH2PO42.31 g/L、K2HPO412.54 g/L;(3)葡萄糖 100 g/L;④乳糖10 g/L。

發(fā)酵條件:3 L發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，1.5 vvm，培養(yǎng)周期24 h。

001×7，001×8，001×10和 ZGSPC106ca四種型號(hào)的樹脂均購(gòu)買于浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī)(EPPENDORF);UV2450紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU);核酸蛋白純化系統(tǒng):HD-A電腦采集器，CHL-ZD定時(shí)數(shù)顯恒流泵，HD-3紫外檢測(cè)儀，BS-100A自動(dòng)部份收集器(上海青浦滬西儀器廠);電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);HYG-IIa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)控?fù)u瓶柜(上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

稱取一定質(zhì)量的樹脂于三角瓶中，用去離子水浸泡12 h后，反復(fù)洗滌樹脂，直至出水清晰、無(wú)異味、無(wú)細(xì)碎樹脂為止;再用約2倍樹脂體積的4%的HCl溶液浸泡樹脂4 h，傾出酸液，用去離子水洗至出水呈中性;然后用約2倍樹脂體積的4%左右的NaOH溶液浸泡樹脂4 h左右，傾出堿液，用去離子水洗至出水呈中性;再用約2倍樹脂體積的4%的HCl溶液浸泡樹脂4 h，用去離子水洗至出水呈中性。預(yù)處理好的樹脂貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 發(fā)酵液預(yù)處理

用離心機(jī)離心后去除菌體，收集上清液。由于發(fā)酵液中除了氨基葡萄糖之外，還有相當(dāng)多的N-乙酰氨基葡萄糖，為了使N-乙酰氨基葡萄糖脫去乙酰基，在發(fā)酵液中加入0.1 mol/L的HCl，100℃水浴3 h。氨基葡萄糖的轉(zhuǎn)換完成后將發(fā)酵液冷卻，由于發(fā)酵液中還含有色素，按照100∶4(質(zhì)量比)加入硅藻土充分吸附后過濾。預(yù)處理好的氨基葡萄糖放于4℃冰箱保存待用。

1.3.3 樹脂的選擇

取預(yù)處理好的001×7，001×8，001×10和 ZGSPC106ca四種型號(hào)的樹脂各2 g于100 mL三角瓶中，各加入10 mL處理好的發(fā)酵液，封好后放于37℃，180 r/min搖床上，振蕩6 h后從搖床上取下，測(cè)上清液中的氨基葡萄糖含量，對(duì)比各個(gè)型號(hào)樹脂的吸附率，選擇一種較為合適的樹脂。

1.3.4 樹脂靜態(tài)交換容量和吸附率的測(cè)定

式中，Qe為樹脂交換容量，mg/mL樹脂;C0為發(fā)酵液中氨基葡萄糖初始濃度，g/L;Ce為吸附平衡時(shí)氨基葡萄糖濃度，g/L;V為發(fā)酵液初始體積，mL;VR為濕樹脂體積，mL;E為樹脂吸附率。

1.3.5 最適緩沖液的確定

選用苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂001×8吸附氨基葡萄糖，靜態(tài)試驗(yàn)確定樹脂吸附氨基葡萄糖的緩沖液的最適pH。

1.3.5.1 緩沖液傾出法

配制pH值從2到8共12個(gè)梯度的緩沖液，取預(yù)處理好的樹脂2 g于15 mL離心管中，用緩沖液充分平衡后傾去緩沖液，加入預(yù)處理好的發(fā)酵液4 mL。放在37℃，160 r/min的搖床上充分振搖約12 h。取出靜置30 min。測(cè)定上清液中氨糖的含量。

1.3.5.2 緩沖液未傾出法

配制pH值從2.2到8共7個(gè)梯度，取預(yù)處理好的樹脂1 g于15 mL離心管中，加入10 mL緩沖液平衡樹脂后加入預(yù)處理好的發(fā)酵液2 mL。放在37℃，160 r/min的搖床上充分振搖約16 h。取出靜置30 min。測(cè)定上清液中氨糖的含量。

1.3.6 吸附飽和曲線的確定

把用最適緩沖液平衡后的樹脂2 g加入100 mL的三角瓶中，加入35 mL的發(fā)酵液，放在180 r/min的搖床上，間隔取樣，測(cè)其中的氨糖濃度。

1.3.7 氨糖濃度和吸附溫度的影響

1.3.7.1 氨糖濃度

配制10，20，30 g/L和40 g/L的氨基葡萄糖溶液，取預(yù)處理好的001×8樹脂1 g于100 mL三角瓶中，各加入不同濃度的氨基葡萄糖溶液50 mL，封好后放于200 r/min，37℃搖床，振搖11 h后取下，比較每個(gè)三角瓶中樹脂的吸附率，確定樹脂吸附的最佳氨基葡萄糖濃度。

1.3.7.2 溫度

取1 g樹脂于100 mL三角瓶中，加入30 mL發(fā)酵液，分別在(1)28℃，200 r/min;(2)30℃，200 r/min;(3)37℃，200 r/min的搖床上振搖4 h后取下，比較不同溫度下的吸附率，選擇合適的吸附溫度。

1.3.8 洗脫液的選擇

方法:分別配置 0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.0 mol/L的硫酸銨溶液。吸附飽和的樹脂，用蒸餾水充分洗滌后，取1 g加入100 mL三角瓶中，再加入25 mL洗脫液。放于37℃，180 r/min搖床上振搖24 h后取下，靜置約13 h，測(cè)洗脫液中的氨糖含量，計(jì)算解析率。

1.3.9 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的穿透曲線

樹脂柱型號(hào)為1 cm×10 cm，裝預(yù)處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進(jìn)樣，流速為3.19 BV/h，間隔取樣并檢測(cè)，作樹脂在此條件下的吸附穿透曲線并利用沈金玉等建立的分析吸附穿透曲線的穿透函數(shù)法分析本研究離子交換過程的穿透曲線。求出吸附過程中的一些參數(shù)。該模型假設(shè):(1)離子交換柱橫截面上濃度分布相等;(2)離子交換柱中所有交換區(qū)等長(zhǎng);(3)料液流動(dòng)速度大于固相濃度波動(dòng)速度;(4)料液以平推流形式運(yùn)動(dòng)而且沒有縱向液體擴(kuò)散現(xiàn)象。

1.3.10 優(yōu)化進(jìn)樣流速和洗脫流速

1.3.10.1 優(yōu)化進(jìn)樣流速

固定樹脂柱型號(hào)為1 cm×10 cm，裝預(yù)處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，緩沖液流速3.19 BV/h，進(jìn)樣流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進(jìn)樣，其中:進(jìn)樣量10 mL，洗脫流速1.60 BV/h，進(jìn)樣流速分別控制1.60 BV/h，3.19 BV/h和4.79 BV/h。比較不同進(jìn)樣流速下的吸附效果，確定最佳進(jìn)樣流速。

1.3.10.2 優(yōu)化洗脫流速

固定樹脂柱型號(hào)為1 cm×10 cm，裝預(yù)處理好的001×8樹脂6 g，水洗流速6.37 BV/h，水洗平衡后，用緩沖液平衡樹脂，流速3.19 BV/h，樹脂平衡后進(jìn)樣，其中，進(jìn)樣量為10 mL，進(jìn)樣流速3.19 BV/h，洗脫流速分別為 1.60 BV/h ，3.19 BV/h，4.79 BV/h，6.37 BV/h，7.66 BV/h，比較不同洗脫流速下的洗脫效果，確定最佳洗脫流速。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂的篩選

從圖1中可以看出，所選幾種樹脂的吸附效果相近，而相同條件下，苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂001×8的吸附率最高，可以達(dá)到86.56% ，所以，選擇該樹脂吸附純化氨基葡萄糖。苯乙烯系強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂001×8是在交聯(lián)度為8%的苯乙烯-二乙烯苯共聚體上帶有磺酸基(—SO3H)的陽(yáng)離子交換樹脂，有良好的交換容量和物理穩(wěn)定性。

圖1 樹脂篩選結(jié)果圖

2.2 緩沖液的優(yōu)化

2.2.1 緩沖液未傾出法

圖2 緩沖液未傾出法中不同pH值的緩沖液對(duì)吸附量和吸附率的影響

2.2.2 緩沖液傾出法

從圖1和圖2中可以看出，利用緩沖液傾出法和緩沖液未傾出法效果相同:吸附率隨緩沖液pH的變化而變化。pH值越低，吸附率越高，以pH=2.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸作為緩沖液時(shí)，樹脂對(duì)氨基葡萄糖的吸附效果最好，吸附率可以達(dá)到80%以上。

圖3 緩沖液傾出法中不同pH值的緩沖液對(duì)吸附量和吸附率的影響

2.3 吸附飽和曲線的確定

從圖4可以看出，在第8 h樹脂對(duì)氨糖的吸附基本達(dá)到吸附平衡。離子交換基團(tuán)在發(fā)酵溶液中解離后，能吸引發(fā)酵液中氨基葡萄糖的氨基，在8 h后，樹脂對(duì)氨基葡萄糖的吸附率達(dá)到43%，且隨著時(shí)間的增加，吸附率不再增加，說(shuō)明8 h已經(jīng)達(dá)到吸附平衡，再增加氨基葡萄糖的量樹脂也不會(huì)有吸附行為。

圖4001×8樹脂的吸附飽和曲線

2.4 氨基葡萄糖濃度和吸附溫度的優(yōu)化

2.4.1 氨基葡萄糖濃度的優(yōu)化

從圖5中可以看出，氨基葡萄糖濃度對(duì)吸附率的影響不大，當(dāng)氨基葡萄糖濃度從10 g/L增加到40 g/L時(shí)，吸附率隨濃度增加有所提高，但提高幅度不是太大，考慮到節(jié)省成本和提高效率，可以取原發(fā)酵液直接進(jìn)樣。

2.4.2 吸附溫度的優(yōu)化

分析圖6，可以看出:001×8樹脂對(duì)氨基葡萄糖的吸附屬吸熱反應(yīng)，溫度從28℃升高到37℃，吸附率逐漸提高。但溫度高于30℃時(shí)，吸附率的提高并不太明顯，為了節(jié)約成本，選擇30℃為樹脂吸附氨基葡萄糖的最佳溫度。

圖5 氨基葡萄糖濃度對(duì)吸附率的影響

圖6 溫度對(duì)吸附率的影響

2.5 洗脫液的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中比較了 NaOH，NaCl，(NH4)2SO4和氨水的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(NH4)2SO4的洗脫效果最好。以下是對(duì)洗脫液(NH4)2SO4溶液濃度的優(yōu)化結(jié)果。

圖7(NH4)2SO4溶液濃度對(duì)洗脫率的影響

從圖7可以看出:(NH4)2SO4溶液的濃度從0.3 mol/L增加到0.7 mol/L，吸附率隨著(NH4)2SO4濃度的增加而增加，當(dāng)(NH4)2SO4濃度超過0.7 mol/L時(shí)，吸附率有所下降。即當(dāng)硫酸銨溶液濃度為0.7 mol/L時(shí)，解析率最大，可達(dá)到80%以上，故選擇0.7 mol/L的(NH4)2SO4溶液為洗脫液。

2.6 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)的穿透曲線

發(fā)酵液持續(xù)的流過離子交換柱，剛開始流出液中的氨基葡萄糖濃度為零，隨著時(shí)間的增加，流出液中氨基葡萄糖的濃度逐漸上升，交換區(qū)不斷下移，當(dāng)c=0.05 c0時(shí)(c為流出液中氨基葡萄糖的濃度，c0為原發(fā)酵液中氨基葡萄糖的濃度)，說(shuō)明交換區(qū)已經(jīng)移到離子交換柱的底部，對(duì)應(yīng)的時(shí)間θ0為穿透時(shí)間，當(dāng)c=0.95 c0時(shí)，柱內(nèi)的全部樹脂已經(jīng)達(dá)到飽和交換量，樹脂不再吸附氨基葡萄糖，以c/c0對(duì)時(shí)間t作圖，得到該條件下的穿透曲線(圖8)。

圖8 動(dòng)態(tài)吸附過程的穿透曲線

從圖8中可以看出，該條件下的穿透時(shí)間θ0=9 min，192 min達(dá)到飽和，應(yīng)停止進(jìn)樣，最大進(jìn)樣量為192 mL。

利用穿透函數(shù)法分析離子交換過程的穿透曲線。

圖9 穿透函數(shù)曲線

將穿透曲線用 Lg[1/(1-c/c0)］對(duì)(θ-θ0)在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)上作圖，得到一條直線，說(shuō)明穿透曲線符合穿透函數(shù)模型。依據(jù)該模型，可以求出樹脂吸附氨基葡萄糖的一些參數(shù)，在初始發(fā)酵液中氨基葡萄糖濃度c0=41.998 g/L，進(jìn)樣表觀流速 U=1 mL/min，離子交換柱高度H=10 cm，柱子所裝填料等于6 g時(shí)，穿透函數(shù)曲線斜率β=0.014，穿透時(shí)間θ0=9 min，c/c0=0.632 時(shí)，傳質(zhì)系數(shù) Kf= β/θm=0.007 h-1，傳質(zhì)單元高度Ht=6.714 m，交換區(qū)高度hz=9.302 cm，這些參數(shù)可以為實(shí)驗(yàn)放大提供理論依據(jù)。

2.7 進(jìn)樣流速和洗脫流速的優(yōu)化

2.7.1 進(jìn)樣流速的優(yōu)化

圖10 進(jìn)樣流速對(duì)洗脫率的影響

從圖10看出，進(jìn)樣速度為1.6BV/h時(shí)，填料能夠更充分地吸附氨基葡萄糖，吸附率達(dá)到98.6%，隨著進(jìn)樣流速的增加，吸附率下降，當(dāng)進(jìn)樣流速為4.79時(shí)，吸附率只有75.31%，由于進(jìn)樣速度太小，會(huì)影響生產(chǎn)效率。從生產(chǎn)效率和洗脫率考慮，3.19 BV/h為最佳進(jìn)樣速度，這時(shí)洗脫率可以達(dá)到95%以上。

2.7.2 洗脫流速的優(yōu)化

用0.7 mol/L的(NH4)2SO4溶液洗脫吸附了氨基葡萄糖的樹脂，洗脫流速過快，樹脂會(huì)因?yàn)椴荒鼙怀浞值南礈鞂?dǎo)致洗脫率下降，洗脫速度過慢，會(huì)加長(zhǎng)生產(chǎn)周期，并且可能發(fā)生二次吸附。從圖11看出:當(dāng)洗脫流速為3.8 BV/h時(shí)，洗脫率最高，可以達(dá)到98.35%，選擇3.8 BV/h為洗脫流速。

圖11 洗脫流速對(duì)洗脫率的影響

3 結(jié)論

對(duì)氨基葡萄糖的下游提取工藝，包括發(fā)酵液的預(yù)處理以及樹脂對(duì)氨基葡萄糖的靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附進(jìn)行了研究。由于初始發(fā)酵液中含有較多的色素和一部分乙酰氨基葡萄糖，所以，要盡量的除去色素并將乙酰氨基葡萄糖水解為氨基葡萄糖。本研究以重組大腸桿菌的發(fā)酵液為原料，用離子交換法分離提取發(fā)酵液中的氨基葡萄糖。研究了陽(yáng)離子交換樹脂001×8吸附氨基葡萄糖的影響因素和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。為氨基葡萄糖下游提取放大提供理論依據(jù)。

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ABSTRACTThe fermented broth of restructured E.coli as raw materials was used to extract glucosamine by ion exchange method.The effects of extraction conditions on glucosamine extraction were studied，and cation exchange resin 001 x 8 was selected.The affecting factors and dynamics properties of absorption of glucosamine by this resin were investigated.The optical conditions were:pH 2.2，temperature 30 ℃，elution with 0.7 mol/L of ammonium sulfate solution;Chromatography column Ф1cm x 10 cm，sample amount 192 mL，injection velocity 3.19 BV/h，elution velocity 3.8 BV/h .Under those conditions，adsorption rate reached to 95%and the elution rate was up to 98.35%.

Key wordsglucosamine，ion exchange，separation，elution

Study on Purification of Glucosamine by Ion Exchange

Liang Fang1，Liu Long1，Li Jiang-hua1，2，Hua Zhao-zhe1，2，Du Guo-cheng1，2，Chen Jian1，3
1(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，
Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(劉龍副教授為通訊作者，E-mail:longliu@jiangnan.edu.cn)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.20836003)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973項(xiàng)目)(No.2010CB535014)

2012-04-10，改回日期:2012-04-25