蜂王漿產品中10-羥基-2-癸烯酸的穩定性比較

黨亞麗，張中健，閆小偉

（浙江省醫學科學院藥物研究所，浙江杭州310013）

蜂王漿產品中10-羥基-2-癸烯酸的穩定性比較

黨亞麗，張中健，閆小偉

（浙江省醫學科學院藥物研究所，浙江杭州310013）

10-羧基-2-癸烯酸（10－HDA）是蜂王漿特有的不飽和脂肪酸，在其質量標準中特別規定了含量要求。采用納米技術制備納米脂質體可提高其穩定性，以包封率為評定指標,采用乙醇注入-超聲法制備了10-HDA納米脂質體，并用液相色譜測定其中的10-HDA含量，比較5種蜂王漿產品中10-HDA的含量穩定性。結果發現，10-HDA納米脂質體包封率可達98.3%，同時其含量最為穩定，而其它4種蜂王漿產品中10-HDA含量不穩定，隨著時間的延長呈下降趨勢。

10-HDA含量；蜂王漿產品；穩定性；脂質體

Abstract:10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA)is the special unstaturated fatty acid in royal jelly,which content is ruled in its quality.The lecithin as the main wall material,the 10-HDA nanoliposome was prepared by the ethanol injection-sonication method.Furthermore,five kinds of royal jelly product as the material,the content of 10-HDA was measured by HPLC,and then the 3 month-long stability experiment was carried out.Results showed that the envelope rate of 10-HDA may reach 98.3%using nanocapsule technology to prepare 10-HDA nanoliposome;simultaneously its content stability could be improved.While the 10-HDA content of other four kind of royal jelly production was unstable,the content became lower along with the time.

Key words：10-HDA content;royal jelly product;stability;nanoliposome

10-羧基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA）是蜂王漿特有的不飽和脂肪酸，占鮮王漿總量的1.4%~2.0%，是蜂王漿的標志物，在蜂王漿的質量標準中特別規定了王漿酸的含量要求。我國國家標準規定蜂王漿優等品中10-HDA含量應大于1.6%，合格品應大于1.4%[1]。日本從1980年起就采用了這一指標，并規定進口蜂王漿中王漿酸含量不得低于1.9%。

一直以來人們認為10-HDA具有一定的熱穩定性[2]，在高溫下其含量變化不明顯[3]，近年來研究發現，10-HDA在蜂王漿產品中不穩定，如蜂王漿口服液中的10-HDA穩定性差[4]。李憲華[5]發現2001年~2002年在進出口蜂王漿膠囊中10-HDA穩定性差，這極可能在進出口時受限，造成經濟損失。和健[6]研究表明，軟膠囊成品冷藏時10-HDA的含量穩定，室溫及高溫高濕條件下其含量下降明顯。但多年來，人們一直采用乙醚從新鮮王漿中抽提得到10-HDA，然后添加到蜂王漿產品中以提高10-HDA含量，對其穩定性方面的研究很少。

納米脂質體是由脂質分子構成的雙分子層囊泡，內水相可以包埋水溶性物質，雙分子層可以包埋脂溶性物質。目前，Nafady等[7]制得了巴西蜂膠的β-環糊精包合物。納米蜂王漿最先在日本出現[8]，它是以蜂王漿凍干粉與油脂一起混合制成粒狀芯材，然后在其表面再包上一層被膜材料制成粒狀蜂王漿，可長期保存，質量穩定。本文采用納米脂質體將10-HDA包埋；并以5種蜂王漿產品為研究對象，采用液相色譜法對其中的10-HDA含量進行測定，比較其在蜂王漿產品中的穩定性，目前此方面研究鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

蜂王漿產品包括凍干粉、口服液、膠囊、含片；納米脂質體制備所需材料：卵磷脂（EPC，生化試劑）；膽固醇：華東師范大學化工廠；吐溫80（化學純）；浙江省溫州華僑化學試劑有限公司；10-HDA晶體粗品：江山日行蜂業合作社。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀WATERS 2690；檢測器WATERS 996；分析柱 ZOBAX SB C184.6×250 mm；酶反應器：自制；501型超級恒溫水浴：上海實驗儀器廠；ZX98-1型旋轉蒸發儀；上海有機研究所；VCX50型超聲處理器（20 kHz）：美國 Sonics&Materials公司；CL20-B型冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.1.3 試劑

重蒸水、甲醇、磷酸二氫鉀、濃磷酸、偏磷酸、無水乙醇、內標物（對羥基苯甲酸甲酯）、10-HDA標準品（純度99%以上）。

1.2 10-HDA納米脂質體的制備

1.2.1 原料提純

稱取10-HDA晶體粗品5 g置于250 mL三角瓶中，加入50mL水溶解，置200r/min搖床中振蕩10min。用6 mol/L NaOH調溶液pH為10.0。振蕩搖勻后加入50 mL乙醚 (Ⅰ)置200 r/min搖床振蕩10 min提取雜質，置分液漏斗中靜置3 h～4 h。取下層水液（乙醚層用旋轉蒸發儀回收）用1∶1鹽酸調pH（Ⅱ）至2.0，搖勻，加入50 mL乙醚（Ⅱ）置200 r/min搖床搖勻，靜置過夜，充分提取10-HDA。用旋轉蒸發儀回收乙醚得10-HDA濃縮液，加入5 mL~10 mL乙醇溶解，濾紙過濾，去除不溶于乙醇的雜質，置于平皿內晾干即得10-HDA 粗提品[9]。

1.2.2 提純后原料的預處理

提純后的10-HDA仍有少許不溶解于水，用乙醇溶解原料后離心，除去不溶于乙醇的物質，然后加卵磷脂和膽固醇，測定離心前后對10-HDA含量的影響。

1.2.3 脂質體制備方法

采用乙醇注入-超聲法。稱取卵磷脂（EPL）500 mg、膽固醇（Chol）100 mg、Tween 80300 mg及 50 mg癸烯酸晶體粗品，加入5 mL無水乙醇于55℃水浴至溶，邊攪拌邊用注射器快速將其注入50 mL 0.02 mol/L pH7.0磷酸緩沖液中，攪拌水化30 min，旋轉蒸發除去乙醇（45℃，真空度0.1 MPa，迅速冷卻，冰浴超聲處理4 min（脈沖 1s/1s），4℃靜置過夜，冷凍離心 30min（11000 g，4℃）后充入N2密封，置于冰箱冷藏保存[10]。

1.2.4 評價指標

評價脂質體質量的指標有外觀、粒徑分布和包封率等，其中包封率是衡量脂質體內在質量的一個重要指標。

其中液體介質中10-HDA含量的測定：采用正戊烷洗滌-HPLC法，即取5 mL納米脂質體，加入5 mL正戊烷，漩渦混合3 min，2000 r/min離心5 min，取上層正戊烷液，重復操作一次，合并正戊烷液，氮氣吹干后按照國標樣品處理方法測定10-HDA的含量。

1.3 10-HDA測定方法及穩定性試驗

1.3.1 樣品處理

稱取蜂王漿產品0.2g，稱準至0.0002g置于25mL燒杯中，加預先混合1mL0.03mol/L鹽酸溶液+2mL水+7 mL乙醇的溶液，攪勻，裝入50 mL容量瓶，加25 mL乙醇，邊加邊輕輕搖動，加10.0 mL內標溶液，用乙醇定容，在漩渦混勻器上混合5 min，取出，3000 r/min離心 10 min 待測[11]。

1.3.2 測定方法

試樣經乙醇處理，溶出10-HDA并沉淀蛋白質，加入內標后用乙醇定容,離心，取上清液進行測定。

液相色譜條件：檢測波長為210nm；流動相為50%甲醇50%0.1%三氟乙酸；柱溫35℃；流速1.0 mL/min；運行時間20 min；進樣量2 μL（自動進樣）。

標準溶液測定：精密稱取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 10-HDA標準溶液至10 mL容量瓶中，加2.0 mL內標溶液，用無水乙醇定容，分別進樣2 μL，用峰面積比值計算，應呈線性,求出校正因子F。

1.3.310 -HDA的計算

式中：F為校正因子；Ai為試樣中被測組分峰面積；As為試樣中內標峰面積；ms為內標質量，g；mi為試樣質量，g。

1.3 .4 穩定性試驗

將5種蜂王漿產品置于高溫高濕環境中（40±2）℃，（75±5）%保存3個月測定。各進樣2μL，重復測定3次，取3次平均值。

2 結果與分析

2.1 校正因子測定結果

在選定的色譜條件下，將10-HDA標準品配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 5 個質量濃度水平，每個質量濃度水平進樣3次，取峰面積平均值。10-HDA的質量濃度在進樣量為10 ng~1000 ng范圍內與峰面積呈線性，校正因子F=1.287，標準曲線為：y=159606x-691.43，相關系數 r=0.998（n＝3）。

2.2 10-HDA含量的穩定性

5種蜂王漿產品中10-HDA含量典型的色譜峰見圖1，其中D為凍干粉；K為口服液；J為膠囊；H為含片；N為納米脂質體。穩定性結果見表1。

表1 蜂王漿產品中10-HDA穩定性試驗結果Table 1 The stability of 10-HDA in the product of royal jelly

由表1可見，前4種蜂王漿產品中10-HDA含量不穩定，呈逐漸下降的趨勢。這可能是由于10-HDA的結構中含有雙鍵、羧基和羥基，雙鍵可能發生不飽和脂肪酸的氧化；羧基可能會與氨基（美拉德反應中間產物）反應；羧基可能與多酚物質的羥基發生酯化反應等，因此，10-HDA易受空氣、光線、水分和酸堿等影響產生穩定性方面的問題。

由表1計算可知，10-HDA晶體粗品純度為44.12%，離心后為44.44%，表明用酸處理后離心對10-HDA的含量影響不大，原料經提純后純度為80.5%，因此選用離心處理用于納米脂質體制備的原料。經計算，載量為10%的10-HDA納米脂質體的包封率為98.3%，3個月的穩定性實驗表明10-HDA含量幾乎不變，說明納米脂質體可提高10-HDA在蜂王漿產品中的穩定性。

3 結論

10-HDA納米脂質體含量最為穩定，而其它4種蜂王漿產品中10-HDA含量不穩定，隨著時間的延長呈下降趨勢。

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Comparison on the Stability of 10-Hydroxy-2-Decenoic Acid in Royal Jelly Product

DANG Ya-li,ZHANG Zhong-jian,YAN Xiao-wei
(Institute of Materia Medica,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,Zhejiang,China)

2011-12-20

浙江省醫科院藥物所資助項目（A11005S）

黨亞麗（1978—），女（漢），助理研究員，博士，主要從事保健食品檢測與研發工作。