乳清蛋白酶解物的抗氧化活性研究

許女，西艷雙，楊莉榕

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

乳清蛋白酶解物的抗氧化活性研究

許女，西艷雙，楊莉榕

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

研究在不同的酶種類、[E/S]、酶解時間下，乳清蛋白酶解物的抗氧化活性。結果表明，在胃蛋白酶37℃，[E/S]為0.15%，水解溫度水解時間2 h；胰蛋白酶[E/S]為0.4%，水解溫度50℃，水解時間2 h的條件下，乳清蛋白的酶解物有較強的抗氧化活性。

乳清蛋白；酶解物；抗氧化活性

Abstract:The effect of different types of enzymes,[E/S],hydrolysis time on antioxidant activity of whey protein hydrolysate were studied in this paper.The results showed that the optimum two enzyme hydrolysis conditions respectively was:pepsin[E/S]0.15%,37℃,hydrolysis time 2 h;trypsin[E/S]0.4%,50℃,hydrolysis time 2 h,while the whey protein hydrolysate has a good antioxidant activity.

Key words：whey protein;hydrolysate;antioxidant activity

乳清蛋白主要來源于干酪生產的副產物乳清，是乳沉淀酪蛋白后分離出來的蛋白質，富含多種必需氨基酸，β-乳球蛋白（β－LG）、α-乳白蛋白（α－LA）、牛血清蛋白（BSA）、免疫球蛋白、乳鐵蛋白（LF）、糖巨肽（CGMP）、乳過氧化物酶等多種活性成分，是國際上公認的人體最優質蛋白質補充劑之一[1-2]。國外對乳清蛋白酶解活性肽的研究已經有20多年的歷史，目前已廣泛興起對具有免疫調節、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的乳源活性肽產品的研究開發[3]。國內對乳清蛋白源生物活性肽的研究尚處于起步階段，尤其缺乏對乳清蛋白源抗氧化肽的研究。隨著中國乳品行業的發展，乳清蛋白的產量將會越來越多。盡管目前發現的乳清蛋白源生物活性肽段種類還比較少，并且許多生物活性肽的作用機理尚未完全闡明，但隨著研究水平的逐步深入，有目的地釋放乳清蛋白中潛在生物活性肽片段，對提高乳清蛋白產品的附加值，拓展乳功能性食品及新藥開發領域，增進乳的開發與利用價值，有一定的理論指導意義，對人類健康事業的發展具有較大的促進作用。

本文以乳清蛋白為原料，通過控制胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解條件，制備出具有抗氧化活性的乳清蛋白酶解物（Whey Protein Hydrolysates，WPHs），為乳清蛋白進一步開發利用和抗氧化肽產品的深入研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

乳清蛋白（WP）：新西蘭Tatua Corporate Profile公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶：美國Amersco公司；茚三酮：天津市北辰方正試劑廠；二苯代苦味酰基自由基DPPH：Sigma公司。

1.2 主要儀器設備

F22E型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；J-25型高速冷凍離心機：美國BECKMAN公司；HHS-21-4型數顯恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；0.01級便攜式酸度計pHB-1：廣東省醫療器械廠；JDG-0.2型真空冷凍干燥機：蘭州科近真空技術有限公司；MDF-U4086S型超低溫冷凍冰箱：日本SANYO公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同的酶種類對乳清蛋白酶解物抗氧化活性的影響

稱取乳清蛋白10 g溶于250 mL蒸餾水中，分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶啟動反應。水解過程中維持最適酶反應溫度和pH并不斷攪拌（胃蛋白酶，[E/S]為0.2%，37℃，pH 2.0；胰蛋白酶，[E/S]為 0.8%，50℃，pH 7.0，分別在 0、30、60、90、120、150、180 min 取樣，調 pH為 7.0，煮沸滅酶 10 min，冷卻后，4℃，4000 r/min離心20 min，取部分上清液進行蛋白水解度的測定，其余上清液凍干后，于-20℃保存，用于抗氧化活性分析。

1.3.2 不同的[E/S]對乳清蛋白酶解物抗氧化活性的影響

分別選取胃蛋白酶的[E/S]為0.05%、0.15%、0.3%、0.45%，胰蛋白酶的[E/S]為0.1%、0.4%、1%、1.6%，按照1.3.1乳清蛋白的酶解工藝對乳清蛋白進行酶解，測定其酶解物的抗氧化活性。

1.3.3 乳清蛋白水解度（DH）的測定

1.3.3.1 甘氨酸標準曲線的制作[4]

稱取0.1000g干燥過的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出2.0 mL定容至100 mL得20 μg/mL的溶液。取此液再分別稀釋成含量為2 μg/mL~20 μg/mL的溶液用于標準曲線繪制。取2.00 mL測定用稀釋液于試管中加入1.00mL茚三酮顯色劑，混勻后沸水浴中加熱15min，同時作空白試驗，然后冷水冷卻，加入5.0 mL 40%乙醇溶液（體積分數）混勻，放置15 min后，以空白管調零于570 nm處測定A值。

茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮、0.3 g果糖、10 g磷酸氫二鈉，6 g磷酸二氫鉀定容100 mL。

1.3.3.2 乳清蛋白水解液水解度的測定[4-5]

取乳清蛋白水解液0.50mL定容至50mL，取0.50mL稀釋液于試管中并加入1.50 mL蒸餾水、1.00 mL顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15 min，同時作空白試驗然后冷水冷卻，加入5.0 mL 40%乙醇溶液（v/v）混勻，放置15 min后，以空白管調零于570 nm處測定A值。

利用標準曲線計算水解蛋白液中-NH2的含量（μmol/mL）。

水解度用下面公式計算：

式中：htot為每克原料蛋白質的肽鍵毫摩爾數，查得乳清蛋白htot=8.8（mmol/g）；6.25*N為水解底物蛋白質含（g/L），本實驗乳清蛋白為11.66。

1.3.4 乳清蛋白酶解物抗氧化活性的測定

1.3.4.1 總還原能力的測定[6]

參考Oyaizu的方法并略作改動。稱取乳清蛋白水解物凍干樣品樣品50mg，抗壞血酸5mg分別溶于1mL蒸餾水中，加入 2.5 mL，0.2 mol/L PBS（pH 6.6）和 2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液于試管中混勻，混合物在50℃水浴中反應20 min后，迅速冷卻并加入2.5 mL 10%的TCA，混勻后4000 r/min離心10 min，取上清液3 mL，在上清液中加入0.6 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，再加入3 mL蒸餾水搖勻，以蒸餾水調零，在700 nm處測定吸光度。吸光度值越高，說明反應混合物的還原性越強。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力

采用羅茲-哥特里法（Rose－Gottile）][7-8]進行測定。

稱取50 mg樣品和5 mg抗壞血酸分別溶于2 mL水中，分別加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，混勻。室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越強。

式中：A0為2 mL0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液+2 mL的樣品溶劑，空白對照；Ai為2 mL無水乙醇+2 mL的樣品。

2 結果與討論

2.1 甘氨酸標準曲線的繪制

本試驗采用水和茚三酮法測定水解蛋自質的水解度，如圖1為不同濃度甘氨酸溶液下對應的吸光度值。

2.2 不同的酶種類對乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響

按照1.3.1乳清蛋白的酶解工藝，將凍干的酶解物配制成50 mg/mL的樣品，測定其還原能力、DPPH自由基清除率。結果如圖2，圖3。

酶解物的抗氧化活性與某些特征氨基酸序列存在著一定相關性，但目前還沒有闡明其具體的構效關系。在一定范圍內，隨著水解度的增加，水解液中小分子片段越來越多，因此，可以通過控制水解度，來獲得具有生物活性的目標片段。不同的酶對乳清蛋白中所含的各種蛋白的底物特異性及作用位點不同，因此獲得的酶解產物的肽鏈結構和長度也不同，但其活性卻有可能相同。通常期望得到的具有特定功能的活性肽往往是分子量較小的短肽。用水解度衡量水解的程度，隨水解度的增大得到的短肽相對較多。若單純追求高水解度指標，必然會導致產生較多的游離氨基酸，因此，在檢測乳清蛋白酶解物水解度的同時，應主要檢測酶解物的抗氧化活性。

由圖2可知胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度，在2 h內都隨時間的延長而不斷增大，2 h后胰蛋白酶和胃蛋白酶水解乳清蛋白的水解度都略微下降，說明此時大多數的乳清蛋白已經被酶水解成許多小肽段和游離氨基酸，隨后一些游離氨基酸和小肽又發生了結合作用，使水解度產生降低的現象[4]。

由圖3可知，在2 h以內，兩種酶的乳清蛋白水解物的總還原能力和DPPH自由基清除都隨著水解時間的延長而增強，2 h時達到峰值，其中胰蛋白酶水解物的還原能力A值為0.498，DPPH自由基清除率為35.31%，高于胃蛋白酶水解物的還原能力（A值為0.464，DPPH自由基清26.68%）。

2.3 不同的[E/S]對乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響

按照1.3.2的試驗方法，將凍干的酶解物配制成50 mg/mL的樣品，測定其總還原能力，研究不同的加酶量對乳清蛋白酶解物的抗氧化活性的影響，實驗結果如圖4、圖5。

由圖4和圖5可以看出，在2 h內，乳清蛋白的胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物的還原能力都隨時間的延長而增強，2 h時都達到峰值，2 h后隨著水解時間的延長，還原能力逐漸降低。另外，酶的添加量有一個最適的值，在底物濃度一定的時候，理論上講酶分子越多，則酶與底物之間的作用越頻繁，但隨著酶用量的增加，酶的數量就趨于過剩，單位時間內一部分酶分子不與底物結合，造成水解度增加緩慢，另外，由于酶本身也是一種蛋白質，也會發生酶解，如果加入量太大了則會干擾酶解物的組成和活性[9]。最終確定胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白制備抗氧化產物的最適[E/S]分別為，[E/S]為0.15%和0.40%。

3 結論

本文研究了在不同的酶種類、[E/S]、酶解時間下，乳清蛋白酶解物的抗氧化活性。結果表明，在2 h內，乳清蛋白的胃蛋白酶水解物和胰蛋白酶水解物的總還原能力和DPPH自由基清除能力，都隨時間的延長而增強，2 h時都達到峰值，2 h后隨著水解時間的延長，還原能力逐漸降低；另外[E/S]也有一個最適的值。最終確定，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別水解乳清蛋白制備抗氧化產物的最佳條件為：底物及乳清蛋白液的濃度為 4%，胰蛋白酶[E/S]為 0.4%，50℃，pH 7.0，水解時間 2 h；胃蛋白酶[E/S]為 0.15%，37 ℃，pH 2.0，水解時間2 h。

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[2]王磊,成雪,毛學英.乳清蛋白及其活性多肽的生物學功能研究進展[J].中國農業科技導報,2010,12(5):30-35

[3]蔣與剛,龐偉.乳清蛋白的生物學作用研究進展[J].中國食物與營養,2008(10):49-51

[4]徐思源.乳清蛋白降壓肽的制備及其功能研究[D].哈爾濱:東北林業大學,2007:10-11

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[6]Oyaizu M.Studies on products of browning reaction:antioxidative activities ofproducts ofbrowning reaction prepared from glucosamine[J].Jpn J Nutr,1986,44(6):307-315

[7]Chen H M,Muramoto K,Yamauchi.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digest of a soybean protein[J].J agric Food Chem,1998,46(1):49-53

[8]劉志東,郭本恒,曲映紅,等.酪蛋白酶解物的抗氧化活性研究.天然產物研究與開發,2008,20(1):19-23

[9]劉志東.乳抗氧化肽的分離、純化及生物活性研究[D].上海:上海海洋大學,2008:33-34

Antioxidant Activity of the Hydrolysates of Whey Protein

XU Nü,XI Yan-shuang,YANG Li-rong
（Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University，Taigu 030801,Shanxi,China）

2012-02-29

山西農業大學科技創新基金（2010009）

許女（1979—），女（漢），講師，博士，主要從事乳酸菌及功能性乳制品的研究。