荔枝果肉多酚的提取與分離

馮衛(wèi)華，于立梅，秦艷，李冰霞，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

荔枝果肉多酚的提取與分離

馮衛(wèi)華，于立梅，秦艷，李冰霞，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225）

以荔枝果肉為試驗(yàn)材料，以多酚含量為評(píng)定參數(shù)，提取分離其中的多酚物質(zhì)。以乙醇溶液為提取溶劑，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察了濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度、浸提次數(shù)等影響提取率的幾個(gè)重要因素，得出影響果肉中多酚提取的因素由大到小依次為，提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度>提取溫度，最佳工藝條件為，乙醇濃度70%，料液比1∶11，浸提時(shí)間6 h，浸提溫度40℃，浸提2次，而且荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

荔枝；多酚；提取；優(yōu)化；分離

Abstract:The optimum extraction conditions of phenolics from Litchi pulp were attained at a solvent-to-solid ratio of 11∶1 by agitated maceration with 70%ethanol at room temperature in the dark for 6 h from freezen sample.The residue was extracted repeatedly.The combined extracts were defatted by hexane,and then extracted by diethyl ether-ethyl acetate(1/1)to obtained Litchi phenolic extracts.And Litchi pulp polyphenols were mainly water-soluble polyphenol content,secondly oligomer and monomers content.

Key words：litchi;phenolic compounds;extraction;optimization;separation

荔枝（Litchi Chinensis Sonn.）營養(yǎng)價(jià)值高，風(fēng)味獨(dú)特，被譽(yù)為“嶺南佳果”[1-2]。并且，荔枝中還含有荔枝多酚等多種活性成分，對(duì)降血壓、降血脂、抗腫瘤、防止動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)免疫力均有一定功效[3-7]。

荔枝采后極易褐變腐爛，荔枝深加工生產(chǎn)迫在眉睫。由于，新鮮荔枝釀酒提高了荔枝的商品價(jià)值，是荔枝產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要方向[8]。然而荔枝酒產(chǎn)品在裝瓶后或貨架期時(shí)存在氧化褐變、風(fēng)味劣變等問題，這不僅影響了產(chǎn)品的外觀和風(fēng)味，而且荔枝酒的營養(yǎng)成分也隨之發(fā)生變化，經(jīng)濟(jì)價(jià)值下降。

據(jù)報(bào)道，荔枝與荔枝殼褐變其主要原因是多酚物質(zhì)氧化褐變的結(jié)果[9-10]。荔枝多酚在荔枝果皮葉、果肉、果核種皮中都有分布，荔枝葉及果皮多酚提取已有系統(tǒng)研究[11-12]，如何有效提取荔枝果肉中的多酚，進(jìn)一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的變化，為控制荔枝酒加工過程中褐變，進(jìn)一步改進(jìn)荔枝酒加工工藝，防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)損失提供理論參考。

由于提取條件決定了提取物質(zhì)的提取質(zhì)量和提取率，因而提取工藝很重要[13-14]。傳統(tǒng)的溶劑提取法因成本低、對(duì)活性物質(zhì)選擇性強(qiáng)、易控制等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)中普遍流行[13，15]。本研究選用溶劑提取法提取荔枝果肉中的多酚，以總酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化荔枝果肉多酚的提取條件。

為了有效分離荔枝多酚，對(duì)經(jīng)優(yōu)化浸提的荔枝果肉提取液選用正己烷、乙酸乙酯∶無水乙醚（1∶1）分步萃取分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料預(yù)處理

荔枝：廣州市從化順昌源綠色食品有限公司。

新鮮的荔枝用不銹鋼刀迅速去除果皮、果核，將果肉裝入塑料袋中，立即冷凍（-18℃），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑

沒食子酸、福林試劑：Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO；其它試劑均為分析純。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

W-754紫外可見分光光度計(jì)：北京瑞利分析有限公司；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫市星海王生化設(shè)備有限公司。

1.2 總酚（TPC）的測定

總酚（TPC）的測定采用福林-肖卡法[16]。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.5 g沒食子酸溶于蒸餾水中，然后定容至100 mL，再取此原液0.5 mL稀釋至50 mL，即為標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取 0.05、0.1、0.15、0.25、0.5 mL 于 10 mL容量瓶中，各加3 mL蒸餾水，搖勻，再加0.25 mL福林試劑，充分混勻。1 min后，加入20%Na2CO3溶液0.75 mL混勻，用蒸餾水定容。混合液于75℃恒溫下水浴10 min后，立即冰浴，于760 nm波長下1 cm比色杯比色，由測得的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。空白用蒸餾水代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 測定

取0.25 mL適當(dāng)濃度的樣品液（用提取溶劑稀釋）于10 mL容量瓶中，空白用提取溶劑代替樣品，其余操作同上。根據(jù)測得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得荔枝多酚的含量。荔枝總酚的含量表示為每克新鮮樣品中含有的總酚量（以沒食子酸計(jì)，μg GAE/g FW）。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 浸提溶劑濃度的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，選用濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液作為浸提溶劑，料液比為1∶7，在60℃水浴鍋避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.2 料液比的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，在 60 ℃水浴鍋避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.3 浸提時(shí)間的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%乙醇溶液作為浸提溶劑，料液比為1∶9，在60℃水浴鍋避光浸提2、4、6、8、10 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.4 浸提溫度的確定

用冷凍荔枝果肉為材料，采用80%的乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為 1∶9，在 25、40、50、60、70 ℃水浴鍋分別避光浸提6 h，過濾得到濾液，立即測定其總酚含量。

1.3.5 浸提條件優(yōu)化

在上面單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇為浸提劑，考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度四因素對(duì)荔枝果肉多酚提取效果的影響，擬定四因素三水平，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，分析荔枝果肉多酚在不同浸提條件下的提取率，確定最佳提取條件。

1.3.6 浸提級(jí)數(shù)的確定

以冷凍荔枝果肉為材料，采用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復(fù)提取3次，立即測定每次浸提液中的總酚含量。

1.3.7 荔枝多酚的分離

將荔枝果肉（5.0 g左右）用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復(fù)提取2次，過濾，合并兩次浸提液。將浸提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇（40℃）至體積約為50 mL左右，將濃縮液經(jīng)等體積正己烷萃取去脂8次，再用等體積乙酸乙酯∶無水乙醚（1∶1）萃取荔枝多酚6次，將合并的乙酸乙酯/無水乙醚相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（30℃）至干燥。將合并的水相放在干燥箱中40℃～50℃干燥，將正己烷相、乙酸乙酯/無水乙醚相、水相等干燥物分別定容，測定其多酚的含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)提取試驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)測定均重復(fù)3次。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用SPSS 11.5軟件（SPSS Inc,Chicago,IL,USA）對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，p<0.05表示顯著，p<0.01表示極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

圖1為乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%時(shí)，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結(jié)果表明，采用80%乙醇濃度浸提，提取液中總酚含量最高，多酚含量顯著高于其他浸提液提取的總酚含量（p<0.05）。因此初步確定乙醇濃度為80%比較合適。

2.2 料液比對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

圖 2 為料液比分別為 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 時(shí)，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結(jié)果分析表明，料液比對(duì)荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（p<0.05）。采用1∶13浸提，提取液中總酚含量最高，并且隨著料液比的增大，荔枝果肉多酚浸提量顯著增加p<0.05）。根據(jù)Rubilar等[17]的研究，濃度梯度是提取的動(dòng)力，因而提高料液比對(duì)提取有正面影響。然而，提高料液比雖然有利于總酚的提取，但當(dāng)料液比達(dá)到某一極限時(shí)，再提高料液比收效不大（后一級(jí)料液比較前一級(jí)料液比增加的提取率分別為46.9%、36.7%、28.0%、18.1%）。由結(jié)果分析并考慮到濃縮時(shí)間，可將料液比確定為 1∶9。

2.3 提取時(shí)間對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

圖 3 為浸提時(shí)間分別為 2、4、6、8、10 h 時(shí)，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。

結(jié)果分析表明，浸提時(shí)間對(duì)荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（p<0.05）。采用6 h浸提，提取液中總酚含量最高。顯然，多酚的充分提取需要足夠的浸提時(shí)間，但是由于提取過程中多酚長時(shí)間處于高溫下，造成部分氧化，因而延長提取時(shí)間提取率反而下降[18]，因此，浸提時(shí)間不能太長。因此初步確定浸提時(shí)間6 h。

2.4 提取溫度對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

圖 4為提取溫度分別為 25、40、50、60、70℃時(shí)，荔枝果肉提取液中總酚含量的變化。結(jié)果表明，采用40℃浸提，提取液中總酚含量最高，其總酚含量顯著高于提取溫度分別為 25、50、60、70℃的總酚含量（p<0.05）。顯然，適宜的溫度有利于多酚的提取。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇溫度為40℃。

2.5 各因素綜合變化對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

以上結(jié)果均為單因素變化對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響。為了全面考察乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度4個(gè)因素對(duì)荔枝果肉多酚提取效果的影響，設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn)。因素水平的選擇是由單因素結(jié)果并綜合考慮時(shí)間效應(yīng)而定。因素水平見表1，正交表及正交結(jié)果見表2，根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果，得表3方差分析結(jié)果。

通過表2正交試驗(yàn)分析結(jié)果表明，影響荔枝果肉多酚類物質(zhì)浸提量的因素主次順序?yàn)椋築>C>A>D，即浸提時(shí)間對(duì)荔枝果肉提取液中總酚含量的影響最大，其次為料液比，乙醇濃度又次之，浸提溫度影響最小。荔枝果肉多酚的最佳提取條件為A1B2C3D1，即：70%乙醇按1∶11的料液比在溫度40℃下浸提6 h，荔枝果肉多酚浸提效果最好。表3方差分析結(jié)果表明，浸提時(shí)間對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響達(dá)到極顯著水平（p<0.01）；乙醇濃度和料液比二因素對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響達(dá)到顯著水平（p<0.05）。又通過對(duì)每個(gè)因素的三水平進(jìn)行多重比較，結(jié)果如下：A因素（乙醇濃度）3個(gè)水平最優(yōu)是A1；B因素（提取時(shí)間）3個(gè)水平最優(yōu)是B2；C因素（料液比）3個(gè)水平最優(yōu)是C3，D因素（料液比）3個(gè)水平最優(yōu)是D1。即通過方差分析結(jié)果確定最佳組合依舊為A1B2C3D1。

表1 荔枝果肉多酚浸提條件的因素水平表Table 1 Factors and levels for the optimization of phenolics extraction conditions from Litchi-pulp

表2 荔枝果肉浸提L9（34）正交試驗(yàn)方案及測定結(jié)果Table 2 Results of phenolics extraction from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal design

表3 荔枝果肉浸提L9（34）正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of phenolics extraction results from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal experiment

2.6 浸提級(jí)數(shù)對(duì)荔枝果肉多酚提取的影響

荔枝果肉用優(yōu)化的浸提條件連續(xù)重復(fù)提取3次，測定每次浸提液的總酚含量，見圖5。結(jié)果分析表明，提取級(jí)數(shù)對(duì)荔枝果肉提取液中總酚含量的影響顯著（P<0.05）。然而，第一、二、三次浸提總酚的量占總的總酚浸提量[（1.655±0.009）μg GAE/g FW]的比例分別為60.54%、21.67%、17.79%，第一、二次浸提的總酚量占總浸提量的83.21%。考慮到提取的成本和后續(xù)操作的繁瑣與得率的關(guān)系，因此，本研究確定浸提次數(shù)為2次。

2.7 荔枝多酚的分離

采用優(yōu)化提取條件浸提的荔枝多酚浸提液用正己烷、乙酸乙酯/無水乙醚（1:1）分步萃取，得到荔枝多酚浸提液的正己烷相、乙酸乙酯/無水乙醚相和水相，分別測定此三相中總酚的含量（圖6）。結(jié)果分析表明，三相中多酚含量差異顯著（p<0.05），其中，水相的總酚含量最高，乙酸乙脂/無水乙醚相的總酚含量次之，正己烷相最小，根據(jù)Calliste等[19]的研究，水相中含有的酚類物質(zhì)多為多酚的多聚體，而正己烷相及乙酸乙酯/無水乙醚相則為多酚的低聚體和單體。因此，荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

3 結(jié)論

本研究選用溶劑提取法提取荔枝果肉中的多酚，以總酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了荔枝果肉多酚的提取條件。影響荔枝果肉多酚提取的主要因素是浸提時(shí)間，其次為料液比，乙醇濃度又次之，浸提溫度影響最小，荔枝果肉多酚浸提的最佳工藝條件即為：采用70%乙醇，按1∶11的料液比在溫度40℃下浸提6 h，在此條件下浸提2次。荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚體為主，其次是低聚體和單體。

本研究為進(jìn)一步研究了荔枝多酚的成分與組成、荔枝多酚的生物活性，進(jìn)一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的變化，為控制荔枝酒加工過程中褐變，進(jìn)一步改進(jìn)荔枝酒加工工藝，防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)損失提供理論性指導(dǎo)。

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The Optimum Extraction of Phenolic Compounds in Litchi Pulp

FENG Wei-hua,YU Li-mei,QIN Yan,LI Bing-xia,BAI Wei-dong
（College of Light Industry and Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,Guangdong,China）

2011-11-24

國家科技部星火計(jì)劃項(xiàng)目（2007EA781003）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007B023001002）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007ZE0091）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C6-I051）；仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（G2360280）

馮衛(wèi)華（1968—），女（漢），副教授，博士，研究方向：果蔬貯藏與加工、生物活性成分提取純化及功能分析。