響應面法和正交試驗對骨素酶解工藝優化的比較

張崟，王衛，張佳敏，蒲登順

（成都大學四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

響應面法和正交試驗對骨素酶解工藝優化的比較

張崟，王衛，張佳敏，蒲登順

（成都大學四川省肉類加工重點實驗室，四川成都610106）

探討酶解骨素的最優工藝及對優化實驗方法的選擇提供借鑒，通過響應面法和正交試驗分析了酶解骨素的最優工藝，并對結果進行比較，發現兩種試驗設計方法在分析各因素對水解度的影響上得出的結果相同，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是響應面法對數據的統計分析優于正交試驗；兩種方法獲得的最優工藝驗證實驗顯示，響應面法得出的最優工藝所得的水解度比正交試驗高出15.4%。酶解骨素的最優工藝確定以響應面法為準，為酶解溫度60℃、酶解時間 5 h、pH 4、酶用量 0.146 mkat/g。

正交試驗；響應面；骨素；酶解

Abstract:The optimal hydrolysis processing for bone extract was investigated by two methods(orthogonal design experiment and response surface design experiment);and the obtained optimal hydrolysis processing from the two methods were compared.The results indicated that the two methods obtained the same results when they were used to analyze the effect of single factors on hydrolysis rate,namely,concentration of enzyme>time>temperature>pH,but the response surface method showed a better analysis than that of the orthogonal method.Verification testing results indicated that the hydrolysis rate,from the optimal processing of response surface method,was 15.4%higher than that of orthogonal method.The optimal processing was decided according to response surface method,and the optimal processing was temperature 60℃,time 5 h,pH 4,the addition amount of papaya protease 0.146 mkat/g.

Key words：orthogonal design experiment;response surface;bone extract;hydrolysis

酶解技術以其溫和的反應條件和高效的催化作用而在畜禽骨利用中廣泛應用。由于酶解時涉及的影響因素比較多，所以采取適當的實驗方法對各因素進行優化以獲得最佳酶解工藝非常必要。在進行優化實驗時，正交試驗或響應面法是常用的實驗設計方法，如在酶解利用雞骨[1]、雞骨泥[2]、骨膠原蛋白中用響應面法獲得最佳的酶解條件[3]；在酶解利用新鮮豬骨[4]、雞骨[5]、羊骨中用正交實驗獲得最優的酶解工藝條件[6]等。

響應面法是由Box和Wilson在1950年最早提出來的用于獲得最優實驗條件的方法，在化學和化學工程領域都有成功的應用[7-8]。正交試驗又稱正交拉丁方試驗，是以拉丁方的正交性為依據，從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，以獲得最優的因素組合和最佳實驗結果，是一種高效率、快速、經濟的實驗設計方法[9]。如今，這兩種實驗設計方法已在食品工業有廣泛的應用。

目前，國內外對這兩種優化實驗設計方法的優化效果優劣的對比較少，這容易導致選擇優化實驗方法時的盲目性。因此，為了探討酶解骨素的最優工藝和對優化實驗方法的選擇提供借鑒，本文將這兩種優化實驗方法同時應用于骨素酶解條件的優化，以探討這兩種優化實驗設計方法應用效果的差別。

1 材料和方法

1.1 材料

木瓜蛋白酶購于北京奧博星生物技術有限責任公司，酶活力8.35 mkat/g；檸檬酸與磷酸氫二鈉、甲醛均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 骨素提取

將清洗干凈的豬骨頭，經PG-150破碎機（廊坊冠通機械有限公司）破碎成塊，然后加入到提取罐進行高溫高壓（0.1 MPa，121℃）煮4 h，將提取液過濾、靜置后采用SO-97油水分離機（上海征富機械有限公司）分離得到骨素。

1.2.2 酶解條件

固定料液比為1∶10（g/mL）。調節pH后加入一定量木瓜蛋白酶，置于DZKW-4水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）酶解不同時間。酶解后取上清液5 mL，用TGL-16G離心機在4000 r/min下離心5 min，所得上清液用于檢測分析。

1.2.3 水解度計算

水解度是指酶解液中游離氨基態氮的含量占總氮量的百分比。游離氨基態氮采用甲醛電位滴定法測定[10]。水解度計算式如下：

水解度/%=酶解液氨基氮/酶解體系總氮×100

1.2.4 響應面設計

采用4因素、7中心、4響應、31次實驗的中心旋轉設計，對木瓜蛋白酶酶解工藝條件進行分析和優化。酶解條件的限值選擇根據文獻[11]。因素編碼及因素水平見表1。

表1 因素編碼及因素水平Table 1 Coded levels of experiment factor for response surfacedesign

1.2.5 正交試驗設計

以溫度 40℃～60℃、加酶量 0.084 mkat/g～0.167 mkat/g、時間 2 h～5 h、pH 4～6 為各因素的變化范圍[11]，選擇L9（34）正交表設計正交試驗。正交試驗因素及水平見表2。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Levels of experiment factor for orthogonal design

1.2.6 數據分析

采用SAS9.0進行響應面設計及數據分析，其余數據利用Excel 2003進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 響應面法優化酶解骨素工藝

2.1.1 酶解條件擬合

響應面實驗方案及試驗結果見表3。

表3 響應面實驗方案及試驗結果Table 3 Response surface program and experiment results

以水解度為因變量，酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量為自變量，對實驗結果進行擬合，所得主擬合模型的顯著性分析見表4，單因素對水解度的影響分析見表5。

表4 數學模型的顯著性分析Table 4 Significant analysis of relativity model

表5 單因素對水解度的影響分析Table 5 Significant analysis of signal factors

表4中p值顯示，水解度與酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量之間存在顯著（P=0.026<0.05）相關性；擬合模型中一次項對水解度有顯著影響（P<0.05）；擬合模型中二次項對水解度的影響不顯著（P＞0.05）。

表5中p值顯示，溫度、時間和加酶量的p值均小于0.05，說明溫度、時間和加酶量對水解度的影響顯著；而pH的p值大于0.05，說明pH對水解度的影響不顯著。比較各因素的p值，可知p加酶量>p酶解時間>p酶解溫度>ppH，因此，各單因素對水解度的影響程度大小依次為酶濃度>時間>溫度>pH，即酶濃度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和溫度，pH對水解度無顯著影響。

2.1.2 酶解工藝條件優化

在建立酶解條件與水解度的數學模型基礎上，對實驗結果進行優化。以水解度為最大值，酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量的極值為評判參考，分析最優工藝，優化結果的響應面見圖1。

由圖1可知，得出溫度60℃、時間5h、pH4、酶用量0.146mkat/g時骨素的水解度最高。由此可知，酶解溫度60℃、酶解時間5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g時，酶解效果最好。

2.2 正交試驗優化酶解骨素工藝

根據單因素試驗確定的酶解溫度、酶解時間、pH值及酶濃度[11]，利用L9（34）正交表建立的正交試驗方案及實驗結果見表6。

表6 L9（34）正交試驗方案及結果分析Table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

續表6 L9（34）正交試驗方案及結果分析Continue table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

對表6中的水解度進行統計分析，所得K值及R值見表6，K值及R值分布見圖2，圖3。

由表6中的K值及圖2可知，溫度60℃、時間5h、pH 4、酶濃度0.167 mkat/g時水解度最高。因此，酶解骨素的最優工藝為溫度60℃、時間5 h、pH 4、酶濃度0.167 mkat/g。

由表6中R值及圖3中R值分布可知，各因素對水解度的影響程度由大到小依次為酶濃度>時間>溫度>pH，即酶濃度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和溫度，pH對水解度的影響最小。

2.3 響應面分析與正交試驗驗證比較

2.3.1 影響因素分析

比較正交試驗及響應面法所得的各因素對水解度的影響程度分析，得出兩者的分析結果是相同的，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是正交試驗對數據的分析不僅信息量少，而且未能體現各因素對水解度是否有顯著性影響，而響應面法對數據的分析比較詳細，不僅可以知道各因素對水解度的影響大小，而且可以知道各因素是否對水解度有顯著性影響。因此，響應面法與正交試驗相比，在對各因素對水解度影響程度及顯著性的分析上優于正交試驗。

2.3.2 優化工藝驗證

通過正交試驗和響應面得到的最優工藝見表7。分別以表7中的酶解條件為反應條件，做驗證試驗，所得水解度見表7。

表7 最優工藝數據對比驗證Table 7 Comparison of verification test results

表7中水解度顯示，用響應面法和正交試驗求出的優化參數獲得的水解度分別為1.613%和1.398%，可見用響應面優化參數獲得的水解度明顯高于正交試驗，而且比正交試驗高出15.4%。

3 結論

通過比較響應面法和正交試驗對酶解骨素條件的優化結果，發現兩種試驗設計方法在分析各因素對水解度的影響上得出的結果相同，即酶濃度>時間>溫度>pH，但是響應面法對數據的統計分析優于正交試驗；兩種方法獲得的最優工藝的驗證實驗數據顯示，響應面法得出的最優工藝獲得的水解度比正交試驗高出15.4%。總之，在酶解骨素工藝的優化上，響應面法優于正交試驗。酶解骨素最優工藝的確定以響應面法為準，最終確定為酶解溫度60℃、酶解時間5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g。

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Comparison of the Optimized Hydrolysis Processing for Bone Extract Obtain by Orthogonal and Response Surface Design Experiments

ZHANG Yin,WANG Wei,ZHANG Jia-min,PU Deng-shun
（Sichuan Province Key Laboratory of Meat Processing，Chengdu University,Chengdu 610106,Sichuan,China）

2011-11-11

張崟（1981—），男（漢），副教授，研究生，研究方向：農產品加工與保藏。