懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝優化

李超柱，陳艷輝，顏穆英，黃學仁，黃貴秋

（欽州學院，廣西欽州535000）

懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝優化

李超柱，陳艷輝*，顏穆英，黃學仁，黃貴秋

（欽州學院，廣西欽州535000）

對懷地黃和懷山藥混合提取多糖的工藝參數進行研究。通過考察提取溫度、固液比、提取液pH、浸提液與乙醇添加量對懷地黃和懷山藥混合提取多糖的影響，采用L9（33）正交試驗，以多糖含量作為指標，確定混合提取多糖的最佳溫度、pH、固液比。結果：懷地黃和懷山藥混合提取多糖的最佳工藝參數為，浸提溫度65℃、浸提液pH 5.0、固液比為1∶20（g/mL）、浸提液濃縮比為4∶1，沉降劑乙醇添加量6倍于浸提液體積，混合提取多糖率為44.78%。

懷地黃多糖；懷山藥多糖；提取工藝

Abstract:This essay research on Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted process parameters.By examining the effect of extraction temperature,solid-liquid ratio,extracting solution pH,extract and ethanol adding to Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted,using the L9(33)orthogonal experiment,use an indicator of polysaccharide content to conform the mixed extract polysaccharide of the best temperature,pH,solid-liquid ratio.Result:Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted optimal parameters as follows:extraction temperature of 65 ℃,extracts of pH 5.0,solid-liquid ratio of 1∶20(g/mL),the extract concentration ratio of 4∶1,the settlement agent ethanol add six times the volume of the extract;mixed polysaccharide extracted was 44.78%.

Key words：Rehmannia polysaccharide;huai yam polysaccharide;extraction process

懷地黃[Rehmannia glutinosa f.Yhueichingensis(Chan et Schih）Hsiao，簡稱 RG]為玄參科植物，是常用中藥，始載于《神農本草經》列為上品。熟地是生地的炮制品，具有益精填髓、滋陰補血的功能。用于肝腎陰虛、目昏耳嗚、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、內熱消渴、血虛痿黃、心悸怔仲、月經不調、崩漏下血、眩暈耳嗚、須發早白等癥。懷山藥（Dioscorea opposite Thumb f.Yhueichingensis Hsiao，簡稱DT），又名山芋、菜山藥，為薯蕷科多年生纏繞型草本植物，是營養豐富的藥食同源植物，是中華民族傳統的保健佳品，素有懷參之稱。據本草綱目記載山藥補虛羸,除寒熱邪氣，補中，益氣力，長肌肉，強陰,久服耳目聰明,輕身延年。李時珍所著本草綱目中記載，山藥有益腎氣、健脾胃、止瀉痢、化痰涎、潤皮毛等功效。現代藥理表明,懷地黃、懷山藥具有多種生物活性，一般認為其主要活性成分是多糖。由于目前天然產物提取往往采用分別提取而忽略天然產物混合提取，而研究表明，懷地黃和懷山藥混合提取一方面可提高得率，二方面有較好的藥用效果，因此對天然產物混合提取的研究可將提高它們的經濟效益[1-5]。

本試驗通過綜合考察溫度、固液比、提取液pH、浸提液與乙醇添加量對懷地黃和懷山藥混合提取多糖效果的影響，確定最佳提取工藝，為深入開展懷地黃多糖和懷山藥多糖的綜合利用提供理論參考。

1 材料和儀器

1.1 原料和試劑

懷地黃、懷山藥：均購于欽州市農貿市場；乙醇、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚試劑：均為分析純，購于南寧藍天實驗設備有限公司產品；濃硫酸為優級純。

1.2 儀器

LB610型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計：上海第三分析儀器廠；RE-5299A旋轉蒸發儀：上海笠化儀器設備有限公司；FW－100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法

2.1 標準曲線的繪制

精確稱取干燥的無水葡萄糖 (105℃干燥至恒重)標準品25.3 mg，于500 mL容量瓶中加蒸餾水定容。分別精確吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL標準液于比色管中，各加蒸餾水至2.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5 mL，迅速振蕩均勻，室溫顯色40 min。另取1 mL蒸餾水，加入等量苯酚溶液和濃硫酸，作為空白對照，將上述試樣置于SP-2000 UV型紫外可見分光光度計中，于最大吸收波長490 nm處測定吸收度,以吸光度（Y）為縱坐標，對葡萄糖含量（X）為橫坐標，繪制葡萄糖含量的標準工作曲線，見圖1。

經回歸分析，得到回歸方程Y=0.06741+0.01243X，葡萄糖濃度在0.00506 mg/mL～0.04554 mg/mL范圍內呈線性關系，R2=0.99966。

2.2 懷地黃和懷山藥混合提取多糖的工藝路線

2.2.1 浸提液與乙醇對多糖的提取

稱取懷地黃和懷山藥（1∶1）40.2953g，粉碎至100目，加入30倍水，浸提4 h，3000 r/min離心30 min,離心收集得到第1次浸提液。向藥渣中加入20倍水，90℃下浸提2 h后離心收集得到第2次浸提液，合并2次收集的浸提液，各取200 mL Sevag法加入40 mL的Sevag試劑（氯仿與正丁醇體積比為5∶1的混合液），劇烈振蕩30 min，離心，回收上層清液，重復上述步驟，進行第2次蛋白的去除，離心后取上層清液減壓濃縮至原液體積1/4，采用不同的濃縮倍數和沉降劑（乙醇）添加量進行沉降，3500 r/min離心，收集沉淀物，分析多糖得率。

2.2.2 正交試驗的設計

懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝條件的設計見表1，分別在不同條件下進行懷地黃和懷山藥混合提取多糖，并測定相應條件下多糖含量。

表1 懷地黃和懷山藥混合提取多糖正交試驗因素水平表Table 1 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment factor level table

2.3 多糖得率的測定方法

利用苯酚-硫酸法對供試液懷地黃與懷山藥混合多糖含量進行測定，取2 mL多糖供試液，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5 mL，迅速振蕩均勻,室溫顯色40 min，測定各供試液吸收值，利用回歸方程求得供試液中葡萄糖的得率。多糖得率按下式計算：

式中：X為在Y吸光度下根據回歸方程計算所得的值，ρ[6]為校正系數取 0.9。

3 結果與討論

3.1 浸提液濃縮倍數與乙醇添加量對多糖提取的影響

乙醇是常用的多糖沉降劑。浸提液濃縮倍數（濃縮比）和乙醇添加量是影響多糖沉降的關鍵因素，對RGP的得率有較大的影響，結果見表2。

表2 濃縮比及乙醇加量對多糖得率的影響Table 2 Concentration ratio of ethanol addition on the effect of polysaccharide

由表2可知，浸提液濃縮比為4∶1時，多糖得率達到最高，為46.84%，這說明濃縮后浸提液過稀和過稠都不利于多糖沉降。此外，多糖得率達到最高時乙醇添加量為濃縮液的6倍量，說明盡管沉降劑乙醇可降低多糖溶解度促進沉降，但過低或過高的乙醇添加量又會減少或增加溶液總體積而對沉降產生不利影響。

3.2 懷地黃和懷山藥混合提取多糖工藝條件的選擇與確定

采用正交試驗法優選混合懷地黃和懷山藥（1∶1）提取多糖工藝，在多糖提取中，為了獲得最大多糖含量，并結合生產實際，選擇提取溫度、提取液pH和固液比3個主要工藝參數作為考察因素，每因素選取3個水平，按L9（33）正交表安排試驗，以多糖含量作為衡量提取效率的指標，優選最佳工藝參數。為了提高其統計分析的可靠性，每一條件下進行3次重復試驗（n=3），測定結果取其平均值供統計分析用，見表3。

表3 混合懷地黃和懷山藥提取多糖正交試驗L9（33）方案及試驗結果Table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme andresults

續表3混合懷地黃和懷山藥提取多糖正交實驗L9（33）方案及實驗結果Continue table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme and results

由表3可見，因素A（提取溫度）對混合物多糖的提取有顯著影響，而因素C（pH）、B（料液比）對提取無顯著影響。由極差R得出影響因素大小順序為：A>B>C。最佳提取工藝參數為A2B1C2。依據上述最佳工藝A2B1C2驗證（n=3），懷地黃和懷山藥混合提取多糖平均含量為44.78%。

4 結論

懷地黃和懷山藥混合提取多糖的最佳工藝參數為：浸提溫度 65 ℃、浸提液 pH 5.0、固液比為 1∶20（g/mL）、浸提液濃縮比為4∶1，沉降劑乙醇添加量6倍于浸提液體積；混合提取多糖率為44.78%。可為深入開展懷地黃多糖和懷山藥多糖的綜合利用提供理論參考。

[1]李紅霞,許閔,孟江,等.懷地黃多糖的含量測定[J].河南科學,2002,20(2):144-146

[2]李靜靜,繆娟,張磊,等.懷山藥多糖分析方法及生物活性的研究進展[J].安徽農業科學,2010,38(35):20008-20009,20039

[3]王洪新,王遠輝.山藥多糖研究進展[J].食品與生物技術學報,2011,30(3):321-325

[4]原增艷,劉紅記,劉新育,等.響應面分析法優化懷地黃多糖的微波提取工藝[J].中國農學通報,2010,26(9):60-64

[5]陳曦,駱健美,王敏.懷地黃和懷山藥多糖同步提取工藝研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(5):1228-1230

[6]張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].上海:上海科學技術出版社,1987:6-7

The Optimization Process of Extracting Polysaccharide from the Mixture of Rehmannia and Huai Yam

LI Chao-zhu,CHEN Yan-hui*,YAN Mu-ying,HUANG Xue-ren,HUANG Gui-qiu
（Qinzhou University,Qinzhou 535000,Guangxi,China）

2012-03-13

李超柱（1957—），男（漢），副教授，學士，研究方向：天然產物化學和有機合成。

*通信作者：陳艷輝（1958—），女（漢），教授，學士，研究方向：天然產物化學和有機合成。