高效液相色譜法測(cè)定甲魚油中EPA、DHA的含量

賴春華，李軍生，廖永聰，廖誠(chéng)珍，謝志揚(yáng)，陳鐵英

（1.廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006；2.貴港市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西貴港537100；3.柳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣西柳州545006）

高效液相色譜法測(cè)定甲魚油中EPA、DHA的含量

賴春華1，3，李軍生1，*，廖永聰2，廖誠(chéng)珍2，謝志揚(yáng)2，陳鐵英3

（1.廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西柳州545006；2.貴港市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西貴港537100；3.柳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣西柳州545006）

建立分離檢測(cè)廣西黃沙鱉甲魚油中的EPA和DHA的高效液相色譜法。試驗(yàn)采用島津VP-ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇和水（體積比 70∶30），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm ，流速為 0.7 mL/min，柱溫為30℃。甲魚油經(jīng)0.5 mol/L KOH-乙醇溶液進(jìn)行皂化，三乙胺-溴苯乙酮酯化后直接上機(jī)分析。結(jié)果表明：EPA、DHA在0.025 mg/mL~0.15 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2EPA為0.9991、R2DHA為0.9995；該法用于甲魚油的檢測(cè)，回收率EPA為96.00%～98.67%，DHA為92.00%～98.00%，該法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好。

黃沙鱉；DHA和EPA；高效液相色譜；甲魚油

Abstract:A high performance liquid chromatographic(HPLC)method was established for the determination of EPA and DHA in Chinese yellow sand soft-shelled turtle oil.The analysis was performed on shimADZU-PACK VP-ODS column (250 mm × 4.6 mm,5 μm)at the detection wave length of 254 nm.The mobile phase was consisted of methanol-water（volume ratio was 70∶30）as a flow rate of 0.7 mL/min at column temperature 30 ℃.The tutrle oil saponificatied by 0.5 mol/L KOH-ethanol solution and esterified by Triethylamine-αbromoacetophenone after analysis.The results showed that the calibration curve was linear in the concentration range of 0.025 mg/mL-0.15 mg/mL (R2EPA=0.9991,R2DHA=0.9995).The recoveries ranged from 96.00%to 98.67%for EPA and 92.00%-98.00%for DHA.The method was fast,simple and accurate.

Key words：Chinese yellow sand soft-shelled turtle;EPA and DHA;high performance liquid chromatography(HPLC);turtle oil

甲魚，別名鱉、水魚、團(tuán)魚和王八等，屬爬行綱[1]，龜鱉目，鱉科，鱉屬，甲魚是我國(guó)傳統(tǒng)的上等中草藥材，具有極高的藥用價(jià)值，是滋陰補(bǔ)腎的佳品，有滋陰壯陽(yáng)，軟堅(jiān)散結(jié)、化淤和延年益壽的功能。甲魚全身是寶[2]，其肉、甲、血、頭、膽、卵、脂肪均可入藥。甲魚油來(lái)源于甲魚的脂肪油，它富含ω-3多不飽和脂肪酸，主要包括[3]α-亞麻酸（α－linolenic acid，ALA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）。具有多種生物學(xué)活性，是維系人類進(jìn)化和健康長(zhǎng)壽的重要物質(zhì)[4]。具有保護(hù)視力、增智、健腦、抗癌[5]、降低膽固醇的作用和免疫功能[6]等生理功能。甲魚油脂在體內(nèi)分布較集中，易取得，脂肪含量高，完全可以單獨(dú)加工成各種保健食品及保健藥品[7]，以提高人們的生活水平及健康水平，且對(duì)甲魚原有的利用不受任何影響，可謂一舉兩得，所以甲魚脂肪開發(fā)利用前景廣闊。多年來(lái)人們研究魚油的EPA、DHA較多[8-12]，在甲魚油方面的研究很少，金妙仁等[13]研究了甲魚油的制備及其理化性質(zhì)，本文對(duì)廣西盛產(chǎn)的黃沙鱉甲魚油中的EPA、DHA含量進(jìn)行了測(cè)定，為深度開發(fā)和利用黃沙鱉甲魚油的特殊營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃沙鱉：廣西貴港水產(chǎn)技術(shù)推廣站提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

DHA和EPA（純度大于99%）：Sigma公司；甲醇（色譜純）：天津四友公司；水為雙蒸水；溴苯乙酮（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器

LC-10ATvp高效液相色譜儀（SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、LCsolution色譜工作站）：日本島津；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：島津 VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇—水（體積比70：30）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別準(zhǔn)確吸取1 mg/mL的EPA和DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，用高純氮?dú)獯抵两桑尤?滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L KOH-乙醇溶液中和至終點(diǎn)，并再次用氮?dú)獯蹈桑藰悠反セ?/p>

1.3.3 樣品處理

取一定量的脂肪塊，按照GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測(cè)定方法》提取粗脂肪。準(zhǔn)確稱取0.0550 g甲魚油樣品，加入0.5 mol/L KOH—乙醇溶液4 mL，充氮?dú)夂笤?0℃水浴中加熱30 min，冷卻后加入l滴酚酞指示劑，用鹽酸一乙醇溶液中和至終點(diǎn)，離心分離定容10 mL，取上清液0.5 mL，用氮?dú)獯蹈?，此樣品待酯化?/p>

1.3.4 酯化

標(biāo)準(zhǔn)品和甲魚油樣品經(jīng)上述處理后，加10 mg/mL三乙胺的丙酮溶液0.2 mL及10 mg/mL ω-溴苯乙酮的丙酮溶液0.4 mL，充入氮?dú)猓?0℃水浴加熱15 min，冷卻后定容，為待測(cè)酯化物。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白試驗(yàn)

由于實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用衍生法測(cè)定，在酯化后未經(jīng)萃取就直接進(jìn)樣，因此得考慮準(zhǔn)備過(guò)程中所加試劑是否影響待測(cè)物質(zhì)的檢出。在不加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的情況下，對(duì)酯化后的溶劑進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，判斷干擾成分。所得的色譜圖如圖1。

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相為甲醇和水，通過(guò)調(diào)節(jié)不同比例流動(dòng)相來(lái)選擇最佳分離條件。通過(guò)甲醇和水的比例為：85∶15；80∶20；75∶20；70∶30；65∶35，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng) V甲醇∶V水＝70∶30，流速為 0.7 mL/min 時(shí)，EPA 和 DHA 分離完好，色譜峰尖銳。結(jié)果表明，如圖2、圖3。

2.3 線性范圍的考察及檢出限

分別精密吸取 EPA：0.025、0.05、0.075、0.100、0.125、0.15 mg/mL 和 DHA 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)樣，按上述條件測(cè)定峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)X、峰面積為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果為：工作曲線Y=1.4×107X+2.6×105，R2EPA=0.9991；Y=6.9×106X+1.1×105，R2DHA=0.9995；表明在 0.025 mg/mL~0.15 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，EPA和DHA線性關(guān)系良好。將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣，測(cè)其峰高響應(yīng)值及基線噪音強(qiáng)度，以3倍信噪比計(jì)算，EPA檢出限為0.0015 g/L、DHA檢出限為0.0027 g/L。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取一定濃度的EPA、DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按1.3.1色譜條件，重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果EPA和DHA的RSD分別為0.46%，0.67%。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一批甲魚油樣品6份，按1.3.3和1.3.4方法處理，同上述色譜條件，測(cè)定峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果EPA和DHA的RSD分別為0.36%、0.53%。

2.6 回收率的測(cè)定

取不同含量的甲魚油樣品4份，加入相同量的EPA和DHA，做加標(biāo)回收。再取同一甲魚油樣品加入不同量的EPA和DHA，做加標(biāo)回收，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 不同樣品相同加標(biāo)量的回收率Table 1 Spiked recoveries of different sample with the same adder

2.7 樣品的測(cè)定

用本法對(duì)黃沙鱉脂肪提取的甲魚油，按樣品處理的方法和色譜條件測(cè)定甲魚油中EPA、DHA的含量，結(jié)果EPA、DHA含量分別為6.3%和5.6%。

3 結(jié)論

從本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果來(lái)看，2種不同的加標(biāo)方法：EPA回收率為96.00%~98.67%和96%~98%，DHA為97.00%~98.00%和92%~97%；EPA相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19和2.08，DHA為0.65和2.97。誤差和回收率顯示本方法可行，有效，簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好。測(cè)得黃沙鱉脂肪塊中含有約12%的EPA和DHA。

表2 同一樣品不同加標(biāo)量的回收率Table 2 Spiked recoveries of different adder with the same sample

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High Performance Liquid Chromatographic Determination of DHA and EPA in Turtle Oil

LAI Chun-hua1,3,LI Jun-sheng1,*,LIAO Yong-cong2,LIAO Cheng-zhen2,XIE Zhi-yang2,CHEN Tie-ying3
(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China;2.The Fishery Technology Spread Station of Guigang,Guigang 537100,Guangxi,China;3.Liu Product Quality Supersion Testing Institute,Liuzhou 545006,Guangxi,China)

2011-11-18

廣西貴港科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（貴科軟0906013）作者簡(jiǎn)介：賴春華（1985—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物化學(xué)。

*通信作者