UPLC-MS/MS 法分析茶葉中的滅多威農藥殘留

郭靈安，雷紹榮，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省農業科學院分析測試中心，農業部食品質量監督檢驗測試中心，四川成都610066）

UPLC-MS/MS 法分析茶葉中的滅多威農藥殘留

郭靈安，雷紹榮，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省農業科學院分析測試中心，農業部食品質量監督檢驗測試中心，四川成都610066）

建立了檢測茶葉中滅多威殘留的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC－MS－MS）分析方法。茶葉樣品經乙腈提取，氨基固相萃取柱凈化，反相液相色譜對樣品進行分離，采用多反應監測模式（MRM）進行定性、定量分析。結果表明：方法檢出限為 0.5 μg/kg，定量限為 2.0 μg/kg；當添加濃度水平為 10、100 μg/kg 時，加標回收率為 71.9%～113.5%，相對標準偏差為5.3%～12.5%。該法靈敏度高、干擾小、定性準確，適用于茶葉中滅多威殘留檢測，同時可作為液相色譜檢測的驗證方法。

UPLC-MS/MS；茶葉；滅多威；殘留

Abstract:A method was developed for the determination of methomyl residues in tea with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS-MS).The methomyl residues in tea samples were extracted with acetonitrile,the extract was cleaned up by amino solid phase extraction column,then separated by reversed phase liquid chromatography,and determined by UPLC-MS-MS in the multiple reaction monitoring mode.The results showed that:the LOD is 0.5 μg/kg,LOQ is 2.0 μg/kg;when the added level was 10,100 μg/kg,the recovery was from 71.9%-113.5%,and the relative standard deviation was from 5.3%-12.5%.The method can be used as the detection method and also the verification method for HPLC of Methomyl residues in tea,because of high sensitivity,low interference,and accurate qualitative.

Key words：UPLC-MS/MS;tea;methomyl;residues

近日，茶葉中農藥殘留超標和使用違禁藥物的報道備受關注，消費者對食品安全問題再度產生熱議。媒體報道國際環保組織（綠色和平）調查報告稱，有多個國產品牌茶葉含有國家明令禁止在茶葉上使用的農藥滅多威。滅多威被世界衛生組織（WHO）定義為劇毒農藥，中毒癥狀有頭暈頭痛，嚴重者會出現血壓下降或意識不清，長期暴露于該農藥中會破壞人的內分泌系統。滅多威是20世紀60年代中期出現的氨基甲酸酯類（NMCs）殺蟲劑。該類農藥是以甲酸酯為前體化合物發展而來的，具有分解快、殘留期短、低毒、高效、選擇性強等特點，在農作物保護中的使用越來越廣泛[1-3]。

伴隨生活水平和健康意識的提高，人們越來越重視農藥殘留問題。早在2011年9月與12月，歐盟兩次出臺法規，強化對中國輸歐茶葉的口岸抽檢力度。此外，歐盟近年密集出臺茶葉農殘限量標準，使得輸歐茶葉市場準入資格日益嚴苛，農殘檢出率大大提升。歐盟對農殘標準的高要求，也導致了中國茶葉出口受到影響。

隨著農藥殘留分析方法的發展與進步，人們已經對不同介質（如水、水果、蔬菜、小麥、煙草、茶葉等）中氨基甲酸酯類農藥測定進行了相關的研究[2-12]。其中，茶葉基質的檢測方法有氣相色譜法和液相色譜柱后衍生熒光法[11-12]，較為普遍的是液相色譜柱后衍生熒光法，其不足在于衍生試劑易氧化失效造成衍生效果不穩定，影響檢測結果。而且茶葉復雜基質中大量干擾成分使液相色譜的分離也存在一定的困難，影響定性的準確性。LC-MS-MS是快速發展的一種分析技術，具有很高的靈敏度和分離能力，近年來在水果、蔬菜等農殘分析上已有了一些應用，但在茶葉中農殘分析的應用還鮮有報道。因此，建立一個茶葉中滅多威殘留的液相色譜-串聯質譜（LC－MS－MS）分析方法對于茶葉復雜基質中微量農藥殘留的檢測實屬必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉為干樣，粉碎備用；滅多威標準物質（標準溶液，濃度1000 μg/mL，農業部環境質量監督檢驗測試中心）；甲醇（HPLC，美國 SIGMA-ALDRICH）；乙腈（HPLC，美國 SIGMA-ALDRICH）；二氯甲烷（HPLC，美國 Honeywell Burdick&Jackson）；氯化鈉（AR，汕頭市西隴化工廠有限公司）；氨基固相萃取柱（6 mL，500 mg，美國 Agilent Accubond NH2）；試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯質譜儀：美國Waters；R-210旋轉蒸發儀：德國BUCHI；培英THZ-C恒溫振蕩器：大倉市實驗設備廠；DT-1002A電子天平：常熟市金羊砝碼儀器有限公司；微孔濾膜：0.22 μm，天津津騰；實驗室超純化水機：艾科浦，ACD1-2005-U。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

吸取滅多威標準溶液（濃度1000 μg/mL）1mL于10 mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成100 μg/mL的滅多威標準儲備溶液。移取0.1 mL該標準儲備液于10 mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.0 μg/mL的滅多威標準工作液。上機標準使用液用前根據需要用甲醇、水的混合溶液（50+50）稀釋成適當濃度。基質標準使用液用陰性空白樣品溶液稀釋成適當濃度。

1.3.2 樣品制備和提取

稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于磨口錐形瓶中，加入20 mL水，振搖，使茶葉充分潤濕，靜置溶脹20 min，加入50 mL乙腈提取液，置于振蕩器上振蕩1 h，過濾，濾液收集到裝有約5 g氯化鈉（氯化鈉用前于140℃烘烤4 h）的50 mL具塞量筒中，蓋上塞子，震搖1 min，室溫（25℃）靜置2 h。吸取10 mL上層清液（乙腈相）于100 mL梨形瓶中，40℃水浴旋轉蒸干，加入3.0 mL淋洗液（甲醇+二氯甲烷=5+95）溶解殘渣，蓋上塞子待凈化。

1.3.3 SPE凈化

將氨基SPE小柱用4.0 mL淋洗液預淋洗，棄去淋洗液，當液面快到達柱吸附層表面時，將待凈化樣品溶液轉移至SPE小柱中，收集流出液于50 mL梨形瓶中，再用淋洗液洗滌裝樣液的梨形瓶3次（3+2+2 mL），并轉至SPE小柱，合并淋洗液。淋洗液于30℃水浴旋轉蒸發至近干，洗耳球吹干，用甲醇、水的混合溶液（50+50）準確定容至2.0 mL，渦旋使之溶解完全，用0.22 μm的濾膜過濾，待測。

添加回收實驗前處理同空白樣品。即將標準物質添加到樣品，靜置0.5 h后以同樣的方法提取凈化。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C8（2.1 mm ×50 mm,1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5 μL。流動相 A：水，流動相B：甲醇+乙腈=1+1，梯度洗脫，流動相梯度見表1。

表1 流動相梯度表Table 1 The mobile phase gradient table

1.3.5 質譜條件

電噴霧正離子模式（ESI＋）；多反應監測MRM；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：700 L/h。質譜檢測參數見表2。

表2 滅多威質譜參數Table 2 MS parameters of methomyl

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇

文獻報道的提取溶劑有丙酮、石油醚、丙酮/水[2]混合溶劑等。但茶葉基質成分多，用丙酮提取時，提取出的雜質較多，易造成基質干擾。而用乙腈提取，雜質少，凈化后樣品干凈，分析結果的靈敏度、準確度更高。本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取條件的優化

茶葉樣品提取液濃縮時易產生暴沸，導致樣品損失，回收率低。經試驗發現，提取前需加入足夠量的水分使之充分潤濕，并放置一段時間。本實驗中確定，稱取5 g樣品量時，加入20 mL水潤濕樣品能夠明顯減少暴沸的發生。同時為了保證茶葉中農藥提取充分，將提取溶劑體積確定為樣品質量的10倍。

2.1.3 凈化條件的選擇

氨基SPE柱的主要作用力是極性陰離子交換，與極性化合物有較的強結合能力，能將樣品中的滅多威殘留吸附在填料上，最后用中等極性洗脫體系（甲醇+二氯甲烷=5+95）將分析物洗脫下來，色素等雜志保留在SPE小柱上，從而達到凈化、濃縮的目的。

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化

根據以往研究經驗初步確定色譜條件，并進行優化，試驗中采用梯度洗脫，能得到比等度條件下更窄的峰形，而且一定時間高濃度有機溶劑的洗脫能夠減少色譜柱中雜質的殘留，有利于延長色譜柱的壽命。

2.2.2 質譜參數的選擇

滅多威極性較大，易離子化，適合采用ESI源。其含有的氨基甲酰基-OCONHCH3是一個給電子基團，容易得到一個質子，故容易在正離子模式下得到更多的離子，獲得響應[13]。本實驗采用直接進樣方式，在ESI+模式下找到母離子，然后通過調節碰撞能量選擇2個相對豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子（如表2所示）。分析時再結合化合物保留時間等信息，進行定性、定量分析。滅多威標準樣品及樣品加標離子色譜圖見圖1、圖2。

從茶葉空白樣品加標色譜圖（圖2）可以看出，在串聯四級桿多反應監測（MRM）模式下進行檢測，所選的定量離子和定性離子具有很高的特異性，經過SPE小柱凈化處理后的樣品對滅多威目標物質的分析基本不存在干擾。

2.2.3 基質效應的影響探討

液相色譜-串聯質譜檢測時普遍存在基質效應問題，當樣品中的共提取物與被測物一同進入質譜系統，將在一定程度上影響被測物的離子化過程，造成響應信號的抑制或提高[9]。本文對純溶劑標準溶液和基質標準溶液進行比較，結果顯示：茶葉基質對滅多威農藥的離子化有明顯的抑制作用，使得滅多威在樣品基質中的質譜響應值降低了很多，如圖3所示。所以，在定量分析中，要獲得較為準確的分析結果，標準溶液和樣品溶液必須在同樣的基質條件下進行分析，即用空白茶葉基質配制的標準溶液對樣品進行定量，以盡可能地消除或有效降低基質效應的影響。

2.3 方法檢出限、定量限及添加回收試驗結果

試驗分別以儀器3倍信噪比和10倍信噪比求得方法檢出限達0.5 μg/kg，定量限達2.0 μg/kg。選取2個茶葉樣品進行檢測，并做了加標回收試驗。添加水平及回收率結果見表3。

表3 滅多威添加回收率與相對標準偏差(n=3)Table 3 The spiked recoveries and RSD of methomyl(n=3)

分析結果表明，所選特征離子反映出了分析物質的主要特征，靈敏度高，選擇性好，定量分析準確。

3 結論與討論

實驗證明，采用液相色譜-串聯質譜法分析茶葉中的滅多威農藥靈敏度高、干擾小，定性準確，相對液相色譜熒光柱后衍生法也更加簡便，尤其是對微量殘留檢測具有很大的優勢。該法適用于茶葉中的滅多威殘留檢測，同時可作為液相色譜檢測的驗證方法。但需要注意的是，茶葉基質復雜，基質對電離有明顯的抑制作用，如果用試劑標準溶液進行定量分析，回收率低，結果不可靠。因此在定量分析時，必須用基質空白配制標準溶液進行定量分析，以保證結果的準確性和可靠性。另外，測定樣品的定容溶劑用甲醇和水的混合溶液可以降低溶劑效應，使色譜峰形得到改善，有利于準確定量。

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Analysis of Methomyl Pesticide Residues in Tea by UPLC-MS/MS

GUO Ling-an,LEI Shao-rong,ZHONG Ling-li,HU Li,LIANG Li,MAO Jian-fei
（Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Food Quality Inspection and Supervision Center of Agricultural Ministry,Chengdu 610066,Sichuan,China）

2012-04-24

郭靈安（1962—），男（漢），副研究員，學士，研究方向：食品質量安全。