發酵酸菜中嗜熱鏈球菌的分離鑒定與特性研究

王艷萍，欒天奇，郗宏波，李騫，王金菊

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

發酵酸菜中嗜熱鏈球菌的分離鑒定與特性研究

王艷萍，欒天奇，郗宏波，李騫，王金菊

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

從東北自然發酵酸菜中分離篩選得到一株乳酸菌，經形態學鑒定、顯色培養基初步鑒定和API鑒定為嗜熱鏈球菌，命名為ST-111，對其進行生理特性及耐酸、耐鹽試驗的初步研究，該嗜熱鏈球菌在pH 4以下幾乎不生長，最適生長pH為7~10，最適鹽濃度為0%~3%；在MRS液體培養基中菌株生長較快，2 h即達到對數期，12 h達到穩定期時OD600可以達到4.5左右；該菌株產酸能力較強，培養24 h后發酵液pH可降到3.6以下；耐膽鹽試驗和膽固醇移除率試驗結果表明，該菌株具有較強的膽鹽耐受力和較高的膽固醇移除率，在0.1%膽鹽條件下生長良好，在0.1%的膽鹽條件下的膽固醇移除率為42.3%。

嗜熱鏈球菌；鑒定；膽固醇移除率

Abstract:One strain of Streptococcus was separated and screened from natural fermentation sauerkraut,and identified as Streptococcus thermophilus by morphological identification,color-display medium preliminary appraisal and API test,named ST-111.The growth and fermentation characteristics of this strain were studied in detail.The result indicate that this strain's optimum growth pH value is 7-10,optimum growth salt concentration was 0%-3%.The strain grows well and performs high acid-producing ability in liquid MRS,and achieve the log phase in 2 hours and stable phase in 12 hours while the OD600can reach 4.5 or so;the broth pH can drop below 3.6 after cultured for 24 h.Bile tolerance test and cholesterol removal test indicate that the strain has high bile salt tolerance and cholesterol-removing ability.The strain grows well in the MRS broth containing 0.1%bile salt and the cholesterol-removing rate can reach to 42.3%.

Key words：Streptococcus thermophilus;identification;cholesterol-reducing ability

自然發酵的酸菜中存在大量的乳酸菌，是良好的乳酸菌菌種來源[1]。近年來，乳酸菌由于具有特殊的生理活性和營養功能，日益引起人們的重視。酸菜作為一種傳統乳酸菌發酵食品，也越來越受到人們的青睞[2]。深入研究且開發利用東北酸菜資源，對擴大益生菌資源及發現新菌種有著積極的意義。

嗜熱鏈球菌是“公認安全性（GRAS）”的，廣泛用于生產一些重要的發酵乳制品，包括酸奶和奶酪（如瑞士干酪、林堡干酪）[3]。研究表明嗜熱鏈球菌可以產生一些具有功能活性的物質，比如胞外多糖、細菌素和維生素等；此外，嗜熱鏈球菌還具有降低膽固醇的功能[4]。血漿中膽固醇水平過高，是引起動脈粥樣硬化的危險因子。現代研究已發現，動脈粥樣硬化、靜脈血栓形成與膽石癥與高膽固醇血癥有密切的相關性。國內外大量研究表明，膽固醇代謝的紊亂直接與腸內菌群脫抱合作用的減少和對膽固醇還原能力的下降有關，如乳酸菌的存在與血漿膽固醇的減少有直接關系[5]。本研究從酸菜中分離得到一株具有良好的產酸特性的乳酸菌，對其進行了菌種鑒定及對生物學特性研究膽固醇降解率的研究，為其進一步應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

試驗材料：天津市售東北自然發酵酸菜；培養基、生化試劑及染色劑：API試劑盒；MRS培養基、LM 17養基；各種生化試劑和染色液均按文獻所介紹的方法配制[6]。

1.1.2 儀器

Eppendorf 5415 D離心機；金鐘DY-2型厭氧培養箱；瑞利UV-9100紫外可見分光光度計；METTLER TOLEDO 320 pH計；Nikon YS-100光學顯微鏡；SANYO超低溫冰箱；Yamato SM 510滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選

稱取20 g酸菜研磨磨碎，倒入180 mL生理鹽水中，然后進行梯度稀釋，涂布平板后于37℃厭氧培養48 h，挑取典型菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，對獲得的一株革蘭氏陽性鏈球菌菌株劃線分離純化2次~3次后進行接觸酶反應為陰性，基本確定為乳酸菌[7]，于甘油管中在-80℃冰箱內保存。

1.2.2 分離菌株的生理生化鑒定

將純化菌株接種到LM 17培養基上厭氧培養24 h進行培養。生理生化鑒定按照法國梅里埃（BioMerieux）公司的產品使用手冊，采用API 50 CH試劑盒和API CHL培養基進行49種碳水化合物的發酵試驗。菌株依照梅里埃公司的菌種鑒定數據庫鑒定。

1.2.3 分離菌株的生理特性研究

1.2.3.1 生長曲線的測定及pH變化

取培養12 h的菌液以2%的接種量接入MRS液體培養基中，37℃培養，每隔2 h取樣，用分光光度計測定600 nm處的吸光值，以空白培養基作為對照，測定生長曲線。同時每2 h用pH計測定發酵液pH。

1.2.3.2 菌株對不同初始pH、鹽濃度及膽鹽濃度的適應性

取對數生長期的菌液以2%的接種量接入初始pH分別為2~10的培養基中，37℃培養24 h，空白培養基作為對照，于600 nm測定OD值。

取對數生長期的菌液以2%的接種量接入添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、18%NaCl的培養基中，37℃培養基24 h，空白培養基作為對照，600 nm測定OD值。

取對數生長期的菌液以2%的接種量接入添加不同質量分數牛膽鹽的培養基中，37℃培養24 h，以質量分數為0.4%溴甲酚紫作為指示劑，觀察其顏色的變化。

1.2.3.3 體外膽固醇移除率試驗

在MRS液體培養基中添加0.1%的膽汁，同時加入按照Razin[8]等提供的方法制備的膽固醇膠束作為膽固醇膠束，即得MRSO-Chol培養基，最終膽固醇含量在0.1 mg/mL~0.3 mg/mL之間。螺口離心試管中加入10 mL上述培養液，按1%的量接入試驗菌株，37℃培養 24 h；4℃，12000 r/min離心 10 min，按照 Rrudel和Morris[9]的膽固醇測定方法測定上清液膽固醇含量。以未接種的培養液作為對照，兩者之間的差值就是對應菌株降解膽固醇的量。

2 結果與分析

2.1 生理生化鑒定結果

菌株ST-111的菌落形態及顯微形態，見圖1。

由圖1可知，在含有M17的培養基中，菌落呈球形凸起，邊緣整齊，直徑為0.3 mm~2 mm；顯微照片顯示菌株為革蘭氏陽性鏈球菌，因此可初步判斷該菌為乳酸鏈球菌。

圖2為24 h和48 h的API CHL碳水化合物發酵試驗結果，經梅里埃公司的菌種鑒定數據庫查詢，進一步確定菌株是唾液鏈球菌嗜熱亞種，即嗜熱鏈球菌，將其命名為ST-111。

2.2 生理特性研究

2.2.1 菌株的24 h生長曲線及pH變化曲線的測定

圖3為菌液OD值及pH隨培養時間變化的曲線圖。

由圖3可知，菌株生長較快，培養2 h后即進入對數生長期，培養12 h后進入穩定期；同時該菌株產酸速度較快，對數生長期間發酵液中pH下降速度較快，穩定期間pH下降不明顯，產酸速度與生長曲線呈正相關，培養24 h后pH可達3.6以下。

2.2.2 菌株對不同初始pH、鹽濃度的耐受性

菌株ST-111的生長pH范圍，見圖4。

如圖4所示，菌株在pH 2~4的培養基中幾乎不生長。pH 5~7時，培養24 h后，菌濃隨pH升高而增加；pH 7~10時，菌濃基本上保持不變，這說明，菌株生長pH范圍較大，在pH 7附近長勢良好，菌株的最適pH為6~10。不同鹽濃度下菌株生長情況，見圖5。

如圖5所示，菌株具有良好的耐鹽性，在鹽濃度為6%時仍有一定的生長能力，當鹽濃度超過6%時幾乎不生長，該菌株的最適鹽濃度為0%~3%，由于發酵酸菜鹽濃度為2%~4%，因此該菌株適合作為發酵酸菜的發酵劑進行開發。

2.2.3 菌株耐膽鹽能力的測定

牛磺膽酸鈉為人體膽汁中膽酸鹽的主要成分之一，因此選取該鹽對菌株的膽酸鹽耐受性進行研究，人體小腸中膽汁鹽質量分數在0.03%~0.3%之間波動，耐膽鹽能力是益生菌的一項重要指標[10]。菌株ST-111的耐膽鹽能力，見表1。

表1 菌株ST-111的耐膽鹽能力Table 1 Bile tolerance of ST-111

由表1可知，菌株所能生長的最高膽鹽質量分數為0.2%，表明該菌株具有良好的耐膽鹽能力。

2.2.4 體外降膽固醇試驗

2.2.4.1 膽固醇標準曲線

以膽固醇濃度（mg/mL）為縱坐標，吸光度值為橫坐標繪制標準曲線，得到鄰苯二甲醛法測膽固醇的標準曲線，如圖6所示。

2.2.4.2 菌株膽固醇移除率的測定

對照組濃度為0.26 mg/mL，降解后接種ST-111菌株的上清液膽固醇濃度為0.15 mg/mL，降解率達到42.3%，試驗結果表明菌株ST-111呈現一定的降膽固醇能力。

3 討論

本研究從東北酸菜中分離得到一株產酸性狀良好的乳酸菌，經初步觸媒反應及API鑒定為嗜熱鏈球菌，對其生理特性及體外膽固醇移除率進行了初步研究。在37℃下，菌株生長速度較快，12 h后即進入穩定期，并且該菌株產酸速度較快，培養24 h后pH可達3.6以下，此外，該菌株適應初始pH以及鹽濃度的范圍較寬，最適生長pH為7~10，最適鹽濃度為0%~3%，具有良好的耐酸、耐鹽性，具有開發為酸菜發酵劑的潛力。胃腸道生存能力試驗結果表明，該菌株能適應較高濃度的膽鹽環境（正常人體小腸中濃度為0.03%~0.3%），具有較強的生存能力；降膽固醇試驗表明，在含有0.1%膽固醇的MRS培養基中，該菌株的膽固醇移除率為42.3%，具有較高的膽固醇移除率。但是，由于人體小腸環境與體外培養基有很大不同，還需要應用到體內動物模型中去驗證，以進一步論證所篩選菌株的降膽固醇性能。文中所篩選的菌株來自于天然發酵酸菜，具有很高的安全性，同時表現了較強的耐酸、耐膽鹽活性，因此，該菌株具有一定的應用潛力及市場開發前景。

[1]劉曉輝,陳順,高曉梅,等.酸菜中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究[J].中國釀造,2009,203(2):62-64

[2]劉宏生,婁紅,叢立晶,等.酸菜發酵的乳酸菌篩選及初步研究[J].遼寧大學學報,1997,24(1):85-88

[3]Christine Delorme.Safety assessment of dairy microorganisms:Streptococcus thermophilus[J].International journal of food microbiology,2008,126:274-277

[4]Ramya Iyer,Tomar S K,T Uma Maheswari,et al.Streptococcus thermophilus strains:Multifunctional lactic acid bacteria[J].International dairy journal,2010,20:133-141

[5]尹軍霞,沈國娟,沈蓉,等.酸菜汁中降膽固醇乳酸菌的分離鑒定[J].中國食品學報,2008,8(2):47-51

[6]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社,1999:6-125

[7]金鑫.一株降膽固醇乳酸菌的篩選及其生物學特性的初步研究[D].內蒙古:內蒙古農業大學,2008

[8]Razin S,Kutner S,Efrati H,et al.Phospholipid and cholesterol uptake by mycoplasma cells and membranes[J].Biochimica et biophysica acta,1980,598(3):628-640

[9]Rudel L L,Morris M D.Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde[J].Journal of lipid research,1973,14:364-366

[10]王艷萍,王菁蕊,白小佳,等.一株開菲爾源乳球菌的分離鑒定及特性研究[C]//第十四屆中國國際食品添加劑和配料展覽會學術論文集,2010:119-123

Study on Isolation,Identification and Characteristics of a Streptococcus thermophilus from Fermentation Sauerkraut

WANG Yan-ping,LUAN Tian-qi,XI Hong-bo,LI Qian,WANG Jin-ju
（College of Food Engineering&Biotechnology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-12

“十二五”科技部高科技發展研究計劃（863計劃）（2011AA 100904）

王艷萍(1962—)，女（漢），教授，博士，研究方向：食品生物技術。