高效表達L-乳酸的釀酒酵母工程菌構建研究

吳曉燕，張光一

（1.河北省產品質量監督檢驗院，河北石家莊 050051；2.河北經貿大學生物科學與工程學院，河北石家莊050061）

高效表達L-乳酸的釀酒酵母工程菌構建研究

吳曉燕1，張光一2，*

（1.河北省產品質量監督檢驗院，河北石家莊 050051；2.河北經貿大學生物科學與工程學院，河北石家莊050061）

采用基因工程方法和進化工程相結合的策略對釀酒酵母進行遺傳改造，獲得高效表達L-乳酸的釀酒酵母適應工程菌。以酵母丙酮酸脫羧酶基因1為同源序列構建乳酸脫氫酶編碼基因整合片段，并與酵母自主表達質粒pUT332共轉化釀酒酵母菌，篩選具有乳酸脫氫酶活性的轉化子。再通過進一步適應進化篩選高產乳酸的釀酒酵母工程菌。結果表明，工程菌的培養介質組成（g/L）為糖蜜總糖120、玉米黃漿水1000、K2HPO46，起始pH 5.0；發酵條件為發酵時間4 d，接種量10%，攪拌速度650 r/min，通氣量1.5 L/min，發酵溫度30℃。

L-乳酸；適應進化；遺傳改造；農副產品；環境友好

Abstract:An engineered Saccharomyces cerevise strain was constructed by genetic engineering and evolution method.First,construct the integrated chimeric fragment of lactic dehydrogenase(LDH)using yeast pyruvate decarboxylase 1 gene as the homologous integrative site,then co-transform the fragment into the S.cerevise with yeast episomal plasmid pUT332 and select the transformants with LDH activity.Further screen was carried out by adaptive evolution method and obtain the interest strain which grows quickly and secrets L-lactic acid efficiently.The optimized culture media composition(g/L)was molasses 120,corn paste waste water 1000,K2HPO46,pH 5.0.The optimized fermentation parameters are as follow,fermentation time 4 d，inoculating rate 10%，stirring rate 650 r/min，aeration rate 1.5 L/min，fermentation temperature 30 ℃。

Key words：L-lactic acid;adaptive evolution;genetic modification;agricultural by-products;environmentfriendly

L-乳酸作為高科技含量的生物制品，不僅在化學工業中得到廣泛應用，而且已被廣泛應用于食品飼料、醫藥、化妝品生產，市場潛力很大。用釀酒酵母發酵生產L-乳酸，生產工藝簡化、可持續性好，利于環境保護，降低加工成本，更好地滿足聚乳酸生產要求，有廣闊的發展前景。Nobuhiro Ishida[1]等通過在染色體整合牛乳酸脫氫酶基因，構建有效產生L-乳酸的釀酒酵母菌，產量可達55.6 g/L。Satoshi Saitoh[2]等將6拷貝牛乳酸脫氫酶基因整合在葡萄酒酵母染色體上構建高產乳酸菌株，并以甘蔗汁作培養介質，乳酸產量高達122 g/L。光學純度達99.9%。Danilo Porro等[3]將牛的L-乳酸脫氫酶基因在丙酮酸脫羧酶基因突變的Kluyveromyces lactis中表達，使乳酸產量達到109 g/L，轉基因K.lactis菌株大大改進分批補料發酵條件下產量。國內未見酒酵母高效表達L-乳酸的系統研究報道。

以農副產品為原料進行深加工、生產L-乳酸產品，提高農副產品的附加值，提高乳酸生產的經濟效益，又有利于環境保護，減少廢物的排放，促進社會的可持續發展。為了使釀酒酵母有效地產生乳酸，本研究借助丙酮酸脫羧酶編碼基因的啟動子，將乳酸脫氫酶基因整合在酵母染色體上，并結合適應進化技術獲得釀酒酵母工程菌。并采用農副產品或副產物作為發酵介質，對構建高產L-乳酸、菌體生長旺盛的釀酒酵母菌株進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

大腸桿菌（E.coli）DH5α用于基因克隆。工業釀酒酵母菌為本研究室保存，作為出發菌株。各種質粒為本研究室保存，質粒在大腸桿菌中選擇標記為氨芐青霉素抗性（Ampr）。酵母自主表達質粒pUT332攜帶腐草霉素抗性基因[4]。所用酵母在30℃培養，在4℃麥汁斜面保存。

1.2 培養基

LA培養基：大腸桿菌生長培養基LB（0.5%酵母粉、1%蛋白胨、1%氯化鈉），根據需要添加氨芐青霉素（濃度為50 μg/mL），用于質粒擴增。酵母生長復合培養基（YEPD）：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，瓊脂2%。YNB培養基:YNB 6.7 g/L，葡萄糖2%。含腐草霉素250 μg/mL，用于酵母菌轉化子篩選。

1.3 酶和試劑

限制性內切酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產品。小牛胸腺DNA及其它分子生物學試劑為Sigma公司產品。引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

1.4 儀器

RS-1型渦旋振蕩器：北京鼎昊源科技有限公司；Gene PulserTM電轉儀：美國Bio-rad公司；Mini-BeadBeater-1小型珠磨式組織研磨器：美國BioSpec公司；BLBIO-5GJ發酵罐：德國B.Braun生物技術公司；惠普-1100型高效液相色譜儀、HP5890氣相色譜儀：美國Agilent公司。

1.5 細胞破碎液制備[5]

3000 r/min離心5 min收集1×109細胞，首先用pH 7的100mmol/L的KH2PO4洗，然后用pH7的10mmol/L的KH2PO4洗。取100 mg（濕重）酵母細胞加1 g直徑0.5 mm玻璃珠、0.5 mL pH 7的50 mmol/L的KH2PO4（含1 mmol/L MDDT和2 mmol/L MgCl2）的混合液洗。試管在渦旋振蕩器中振蕩1 min，冰浴1 min，重復5次。然后13000 r/min離心1 min，收集上清液。

1.6 目的基因PCR

根據 GenBank（accession number Z81318）報導的瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）的乳酸脫氫酶基因L-LDH基因序列設計引物。引物1：5'-gcggatccagg agatttattgtt-3'，引物 2：5'-ctggtaccgaaaagagatgctc-3'。其5'端有BamHI酶切位點，3'端有KpnI酶切位點。按下面條件PCR，獲得L-乳酸脫氫酶基因，大小1 kb。

根據 GenBank（accession number X04675）報導的釀酒酵母基因組丙酮酸脫羧酶基因為模板設計引物。編碼序列上游序列3：5'-atatatgaattcgcgtttatttacctatctt-3',4：5'-atatatggatcctttgattgatttgactgtg-3',其 5'端 有EcoRI酶切位點，3'端有BamHI酶切位點。編碼序列的下游序列 5：5'-atataggtcgacttgaacgtcccagctaagttg-3',6：5'-atatattctagactcgtcagcaatagtggtcaac-3'，其 5'端有SalI酶切位點，3'端有XbaI酶切位點。按下列條件進行PCR，獲得丙酮酸脫羧酶1的部分啟動子序列和編碼序列的下游序列。

PCR 體系組成（50 μL）：模板1 μL；E.Master酶混合物 25 μL；引物 2 μL×2；重蒸水加至 50 μL。

參數：

1.7 酵母轉化

酵母細胞經10 mL YEPD培養基30℃過夜培養，然后轉接500 mL YEPD培養液（2 L三角瓶）搖床培養至OD600=1.3~1.5。4℃，4000r/min收集細胞重懸于80mL重蒸無菌水，添加10mLpH7.5的10×TE緩沖液、10mL 1 mol/L LiAc，30℃低速振蕩45 min；再加2.5 mL新配制的1 mol/L的DTT，溫浴15 min。酵母懸液用重蒸水稀釋至500 mL，洗3次。細胞重懸于250 mL冰冷的重蒸水，再懸于30 mL冰冷的1 mol/L山梨醇。收集細胞并重懸于0.5 mL冰冷的1 mol/L山梨醇中，調節細胞懸液 OD600=200。向 1.5 mL 離心管添加 40 μL 細胞，5 μL DNA（線性 DNA：質粒 DNA=10∶1，最好是 50ngpUT332）。細胞-DNA混合物轉入帶帽的0.2 cm冰浴電轉移管進行電脈沖處理（1.5 kV，25 mF and 200 ohms），然后立即加入1 mL冰冷的YEPD培養基，30℃輕微振動2 h~4 h。取250 μL涂含腐草霉素的轉化平板，30℃培養3 d~4 d。

1.8 適應進化實驗

保藏菌株涂基本培養基平板，選單菌落接種5 mL液體試管，30℃搖床（40 r/min）培養過夜，然后轉接250mL三角瓶，其工作量50 mL，30℃40 r/min搖床培養3 d。轉接培養7 d。培養細胞重復上面步驟，碳源或鹽濃度增加。培養介質定期更新（3.5 d更新一次），共12次。培養液葡萄糖濃度為20%~30%。碳酸鈉濃度為3%~5%。培養40多天后，取5 mL轉接50 mL培養液培養，再轉接1.0 L YNB介質，（含葡萄糖300 g/L或碳酸鈉5 g/L，發酵1 d。培養物涂平板，挑單菌落依次轉接如上5 mL、50 mL、1.0 LYNB介質（含葡萄糖300 g/L或碳酸鈉50g/L），發酵16h。第3次重復上述步驟發酵13 h。最后收集細胞涂平板。用乳酸調節發酵液的pH<4.6。篩選生長旺盛的適應菌株。

1.9 乳酸脫氫酶測定

YEPD培養基培養，將對數生長期的細胞（OD600=0.8）轉至含0.9 mol/L NaCl的YEPD培養基，30℃培養2 h。離心收集細胞，用等滲鹽溶液洗2次，置于沸騰的乳酸脫氫酶LDH提取緩沖液（0.1 mol/L Mops，pH 7.2，10%甘油,1 mmol/L二硫蘇糖醇），然后酵母用小型珠磨式組織研磨器破碎細胞，添加0.5-mm zirconia-silica珠，然后4℃13000 r/min離心15 min除去細胞碎片，上清液用于乳酸脫氫酶活性測定。

在磷酸緩沖液（73 mmol/L KH2PO4，3.5 mmol/L Na2HPO4，pH 5.6）添加1 mmol/L丙酮酸和0.2 mmol/L NADH，25℃分光光度法測定乳酸脫氫酶活性。酶活性定義為在反應條件下，1 min將1 mmol/L底物還原為乳酸所需的酶量。蛋白質含量用考馬斯亮藍染色法測定，以牛血清蛋白作為測定參照標準。

1.10 發酵實驗

儲存菌株培養物2mL接種250mL三角瓶（100mL YEPD培養介質），30℃150 r/min搖瓶培養至平衡期作為種子培養物。發酵采用合成培養基，發酵罐裝有3 L培養介質，121℃滅菌40 min。發酵罐接種量為1.0×107個/mL~1.5×107個/mL，轉速 650 r/min。控制通氣量1.5 L/min，發酵溫度控制在30℃。如果需要可用10%無菌氨水控制。發酵6 d，每天取樣測定發酵液的pH、細胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。

1.11 分析方法

乳酸、殘糖用高效液相色譜HPX-87H（300 mm×7.8 mm）Aminex色譜柱（Bio-Rad）或DNS法測定。用NucLeosiL 5C-18100A柱。流動相為重蒸水，流速1 mL/min。5mmol/LH2SO4作為洗脫液，流速0.5mL/min。乳酸的光學純度用惠普-1100型高效液相色譜儀測定。Hypersil ODS（C18）色譜柱（150 mm×2.1 mm i.d，5 μm）；流動相：0.65mmol/L2，3，6三甲基β環糊精（TM－β－CD，含 5 mmol/L H2SO4），pH 2.5；流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長：210 nm；進樣量：5 μL；柱溫：室溫。乙醇用氣相色譜測定，采用火焰離子化檢測器。取1 μL注入HP5890氣相色譜儀，配備DBWAX大孔柱。載氣為氮氣，流速為10 mL/min。加樣和檢測溫度分別為240、250℃。爐溫：80℃保持2 min，然后升至200℃，升溫速度10℃/min。

2 結果與討論

2.1 乳酸脫氫酶基因整合片段獲得

2.1.1 乳酸脫氫酶基因LDH獲得

將乳酸脫氫酶基因LDH基因引入釀酒酵母，使其可以用另一代謝途徑再生NAD+，糖酵解轉向乳酸生成途徑，使胞內丙酮酸直接還原為乳酸，導致乙醇和乳酸同時積累。已經證明[6]：瑞士乳桿菌（L.helveticus）乳酸脫氫酶基因LDH可以與酵母的丙酮酸脫羧酶競爭使乙醇生產方向轉至乳酸生產方向。故本研究以瑞士乳桿菌基因組為模板，進行PCR獲得乳酸脫氫酶基因。

2.1.2 乳酸脫氫酶基因嵌合片段構建

將PCR獲得的丙酮酸脫羧酶基因的5'插入pBluescriptM13-的EcoRI/BamHI位點,然后再將3'片段插入SalI/XbaI位點。重組載體1經BamHI+SalI酶切，與將L.helveticus的L-LDH/BamHI+KpnI基因和乙醇脫氫酶下游3'基因片段/KpnI+SalI一同連接，獲得攜帶5'PDC1+LDH+ADH1T+3'PDC1基因片段的重組載體2。用AatII+XbaI酶切獲得該嵌合片段如圖1，大小約為2.9 kb。

2.2 產乳酸釀酒酵母菌株構建

2.2.1 電轉化及整合驗證

通過電轉化法將整合片段與酵母自主表達質粒pUT332轉化工業釀酒酵母菌,在含150 μg/mL腐草霉素的YEPD培養基上篩選陽性轉化子。提取轉化子基因組進行PCR驗證，如圖2，以乳酸脫氫酶基因LDH上游引物和PDC1終止序列的下游引物為引物，獲得基因片段為2.1 kb。表明乳酸脫氫酶基因整合在酵母的基因組上，并破壞丙酮酸脫羧酶1基因。

2.2.2 轉化子的篩選標記丟失培養

對目標轉化子進行YEPD非選擇性培養數代，選擇腐草霉素抗性丟失的菌株進一步研究。

2.2.3 轉化子初步生長研究

對轉化子進行細胞生長及初步發酵性能測試，轉化子30℃培養72 h，接種量為10%。測定L-乳酸產生量最高為48.9 g/L，見圖3。

2.3 轉化子適應進化

研究發現，在高滲透脅迫條件下，酵母細胞通過激活不同的機理合成一些代謝產物并在胞內積累滯留，達到適應存活[5]。酵母細胞中pH越高，生存能力越強，乳酸產量越高。本研究采用高滲脅迫適應和低pH適應相結合的篩選策略。

首先采用高糖/高鹽作為選擇條件誘導菌株發生遺傳改變獲得突變子庫。用30%葡萄糖及5%的碳酸鈉的合成基本培養基進行適應篩選（40 r/min搖瓶培養），使獲得的重組菌株產生抗脅迫能力，并經連續傳代培養28 d（約200代）的系列轉移-稀釋策略，篩選生長旺盛的適應菌株60個；然后用低pH 4.5的合成培養介質（用乳酸調節發酵液的pH<4.5）進一步適應培養，篩選生長旺盛的適應菌株30個。最后，篩選生長旺盛、胞內pH高、乳酸產量高的菌株3個。

2.4 適應菌株發酵優化研究

2.4.1 發酵介質組成優化

對糖蜜、玉米黃漿水、尿素比例進行研究，采用三因素四水平，按正交表L9（34）設計正交試驗，30℃250 mL三角瓶（裝瓶量100 mL）搖床培養48 h，確定培養基最佳組成。優化培養基組成（g/L）：糖蜜總糖120；玉米黃漿水 1000；K2HPO46。

2.4.2 發酵條件研究

1）以菌體接種量、培養基初始pH、培養時間，按正交表L9（34）設計正交試驗，250 mL三角瓶裝有100 mL培養介質30℃200 r/min搖瓶培養，測定乳酸生成量，確定最適初始發酵介質pH 5.0，接種量1.3 cells/mL×107cells/mL，培養 5 d。

2）采用5-L發酵罐（BIOSTAT-B,B.Braun,Germany），介質填充量3 L，發酵介質初始pH 5.0，接種量1.3×107cells/mL。控制溶氧30%~50%，攪拌速度300 r/min~1000r/min，發酵溫度30℃，發酵6d。每天取樣測定發酵液的pH、細胞生物量、糖消耗量、乙醇含量和乳酸含量。

確定最佳發酵條件：發酵介質初始pH 5.0，接種量1.3×107個/mL，發酵溫度 30℃，溶氧 30%，攪拌速度650 r/min，發酵時間4 d。最終得率：乳酸52.2 g/L，乙醇45.8 g/L；49.2%的糖轉化為乳酸，乙醇產生量降低到原來的46.8%。

酵母在不同發酵時期的代謝產物見圖4。

3 結論

聚L-乳酸作為一種非常有吸引力的熱塑性無毒高分子材料，生物相容性好，易與市政環衛管理處理體系結合，沒有白色污染，滿足社會可持續發展要求。本課題獲得高效表達L-乳酸的酵母適應工程菌，可利用價格低廉的糖蜜、玉米黃漿水發酵生產乳酸。發酵介質組成（g/L）：糖蜜120，玉米黃漿水1000，K2HPO46，pH 5.0。最適發酵條件為：發酵溫度30℃，裝液量 60%，接種量 1.3×107個/mL，溶氧 30%，攪拌速度650 r/min，發酵時間4 d。構建的酵母適應工程菌可以用廉價培養介質發酵生產，生產成本低；引入的乳酸脫氫酶基因整合在酵母染色體上，遺傳穩定；沒有引入細菌來源的抗藥性基因，利于食品應用；可以進行高密度培養；酵母酸耐受性強，減少發酵過程中中和劑使用。該酵母適應工程菌的乳酸產量比一般乳酸菌低，仍有部分乙醇產生，今后應進一步進行遺傳修飾，提高L-乳酸產量。由于廉價發酵介質雜質多，發酵后的低成本純化方法選擇具有挑戰性，應繼續進行純化研究，降低純化成本。

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Construction of Commercial Saccharomyces cerevisiae with L-lactic acid Efficient Production Ability

WU Xiao-yan1,ZHANG Guang-yi2,*
（1.Hebei Institute of Product Quality Supervision and Inspection,Shijiazhuang 050051,Hebei,China;2.Bioscience and Bioengineering College,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang 050061,Hebei,China）

2012-03-25

河北省引進留學人員資助項目（2011226）；河北省社會科學發展研究課題（201103161）

吳曉燕(1964—)，女（漢），副研究員，碩士，研究方向：食品安全與可持續發展。

*通信作者：張光一（1964—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：食品安全與可持續發展。