腺苷A2a受體在紅景天苷調節大鼠低氧性肺動脈高壓中的作用*

黃曉穎， 樊 榮， 蔡學定， 張 協， 盧園園， 王良興

(1溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江溫州325003;2揚州市江都人民醫院呼吸內科，江蘇揚州225200)

腺苷是體內重要的內源性生理活性物質，是強大的血管舒張劑，是公認的強效肺動脈舒張劑［1］。腺苷的諸多作用通過其受體所介導。目前已經發現4種腺苷受體(adenosine receptor，AR)亞型，分別是A1AR、A2aAR、A2bAR和 A3AR。A2aAR由于其廣泛的生理病理調節作用而受到人們的關注，在體循環其被腺苷及腺苷類似物活化后，具有舒張血管平滑肌、擴張冠狀動脈和外周動脈的作用［2］;以及抗炎和免疫抑制作用［3］。本實驗擬觀察A2aAR是否能抑制低氧誘導的肺動脈高壓。紅景天苷(salidroside)是景天科植物紅景天的最主要藥理成分，具有抗疲勞、抗缺氧、抗氧化、抗纖維化、清除氧自由基等作用［4］。我們的前期研究發現其具有抑制低氧性肺動脈高壓的作用，本實驗擬研究紅景天苷對A2aAR表達的影響，為臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

1 動物模型的復制和分組

雄性SPF級 Sprague－Dawley(SD)大鼠60只(由溫州醫學院實驗動物中心提供)，體重(200±20)g，隨機均勻分為6組，每組10只。A:正常對照組;B:低氧組;C:低氧+紅景天苷低劑量組;D:低氧+紅景天苷中劑量組;E:低氧+紅景天苷高劑量組;F:低氧+A2aAR激動劑(CGS－21680)組。B～E組大鼠均置于常壓低氧艙，氧濃度控制在8% ～11%，CO2濃度維持在1% ～3%，每天8 h(8:00～16:00)，每周6 d，共4周。B組每次入艙前0.5 h腹腔注射4 mL/kg生理鹽水。C～E組每次入艙前0.5 h腹腔注射紅景天苷(購自南京澤朗醫藥科技有限公司，批號為201112，純度98%，干粉)，低、中、高劑量分別為2 mg/kg、8 mg/kg和32 mg/kg。F 組 CGS－21680(分子式:C23H29N7O6，分子量:535.99，每瓶 10 mg，批號為1063/10，Tocris產品，純度≥98%)的劑量為0.2 mg/kg。

2 平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、平均頸動脈壓(mean carotid arterial pressure，mCAP)和右心指數［right ventricle/(left ventricle+septum)，RV/(LV+S)］的測定

造模4周后，5%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，行頸正中切口，分離右頸外靜脈和左頸總動脈，右心導管法測量大鼠肺動脈壓力。將自制彎頭的聚乙烯導管(外徑1.1 mm，內徑0.8 mm)從右頸外靜脈進入右心室、肺動脈，通過YL－4型壓力傳感器和MedLab生物數據記錄分析系統記錄右心室壓力波和肺動脈壓力波，測定mPAP。左頸總動脈插管，YL－3型壓力傳感器和MedLab生物數據記錄分析系統記錄頸動脈壓力波，測定mCAP。

放血處死動物后，分離心臟，PBS緩沖液洗去血液，棄除心房，沿室間隔把心臟剪開成右心室壁(right ventricle，RV)和左心室加室間隔(left ventricle+septum，LV+S)兩部分，濾紙吸干液體后分別用電子天平稱重，計算兩者的比值RV/(LV+S)來反映右心室重量的變化。

3 光鏡制作標本及觀察

放血處死大鼠，取出大鼠肺組織，迅速置入4%多聚甲醛液中固定，固定24～48 h后取出肺組織，肺門水平橫切，常規脫水、透明、石蠟包埋，連續切片，厚度約4 μm，脫蠟至水，HE染色，顯微鏡下觀察，測量肺小動脈管壁面積(vessel wall area，WA)和管總面積(vessel total area，TA)，并計算其比值WA/TA。

4 免疫組化法檢測各組大鼠肺小動脈管壁A2aAR相對含量

兔抗大鼠多克隆抗體(I抗)購自Thermo，1∶100稀釋，兔二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。肺組織石蠟切片，3%過氧化氫室溫處理，加牛血清封閉，滴加I抗、Ⅱ抗，DAB顯色，陽性結果呈棕黃色。每只大鼠選1張肺組織切片，每張切片隨機選取直徑50～200 μm的肺細小動脈5支，Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測A2aAR的平均吸光度，隨機測定5個高倍視野后計算其平均值，作為該片的A2aAR值。

5 原位雜交法檢測各組大鼠肺細小動脈管壁A2a AR mRNA相對含量

5.1 寡核苷酸探針 地高辛標記的多聚核苷酸探針購自武漢博士德生物工程有限公司。探針序列，A2aAR:(1)5’－AACAG TAACC TGCAC AACGT CACCA ACTTC TTTGT－3’;(2)5’－TGGAA CAACT GCAGT CAGAA AGACG GGAAC TCCAC－3’;(3)5’－AACTG TTTCA CCTTC TTCTG CTCCA CGTGC CGGCA－3’。

5.2 雜交過程 肺組織石蠟切片，脫蠟至水，3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化，地高辛標記的A2aAR寡核苷酸探針雜交，封閉，滴加兔抗地高辛，生物素化羊抗兔IgG，DAB顯色，陽性結果呈棕黃色。每只大鼠取1張肺組織切片，隨機選取5支直徑約50～200 μm肺細小動脈為分析對象，用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測A2aAR的平均吸光度值，隨機測定5個高倍視野后計算其平均值，作為該片的A2aAR mRNA值。

6 大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA表達的檢測

取大鼠右肺組織80～100 mg提取總RNA，逆轉錄為cDNA，行普通PCR先確認標本具有陽性表達后，再用real－time RT－PCR反應體系擴增，使用SYBR Green real－time RT－PCR相對定量的方法。比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，運用2－ΔΔCt方法，得出mRNA的相對表達量。最終結果由PCR儀配套軟件自動計算，引物設計見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

7 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR蛋白的測定(Western blotting)

取大鼠右肺組織80～100 mg，加入400 μL組織裂解液在冰上研磨，冰浴，超聲裂解，離心，取上清(即蛋白提取液)。用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。常規SDS－PAGE電泳(每孔上樣80 μg蛋白)，三明治法恒壓電轉移至PVDF膜(300 mA，40 min)，封閉液室溫封閉。棄去封閉液，滴加A2aARⅠ抗(兔抗大鼠多克隆抗體，稀釋濃度1∶1 000)4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的兔Ⅱ抗(碧云天，1∶500)室溫孵育2 h，洗膜后化學發光顯影。將顯影后的膠片掃描至電腦中，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析A2aAR吸光度。

8 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析。所有數據進行正態性檢驗，計數資料用均數±標準差(±s)表示。多組樣本均數比較用方差檢驗，兩兩比較用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠mPAP、mCAP和RV/(LV+S)的比較

低氧組mPAP顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷中、低劑量組mPAP雖然較低氧組有減低趨勢，但無統計學意義(P＞0.05)，紅景天苷高劑量組mPAP顯著低于低氧組(P＜0.01)。CGS－21680組mPAP顯著低于低氧組(P＜0.01)，見表2。

各組mCAP無顯著差異，見表2。

低氧組RV/(LV+S)顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷低劑量組雖然較低氧組有減低趨勢，但無統計學意義(P＞0.05)，紅景天苷中劑量組低于低氧組(P＜0.05)，紅景天苷高劑量組顯著低于低氧組(P＜0.01)，CGS－21680組顯著低于低氧組(P ＜0.01)，見表 2。

2 A2aAR和紅景天苷對慢性低氧大鼠肺細小動脈顯微結構的影響

光鏡下，慢性低氧組大鼠肺細小動脈管腔明顯狹窄，中膜平滑肌細胞顯著增生，炎癥細胞浸潤;CGS－21680組和紅景天苷組肺細小動脈管腔狹窄程度、中膜平滑肌細胞增生程度、炎癥細胞浸潤程度與低氧組相比明顯減輕。WA/TA較對照組顯著增高(P＜0.01)，CGS－21680組和紅景天苷組均明顯低于低氧組(P ＜0.01)，見表2。

3 各組大鼠肺細小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白含量的比較

低氧組肺細小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達高于正常組(P＜0.01)，A2aAR激動劑組和紅景天苷高劑量組A2aAR mRNA及蛋白表達較低氧組進一步升高(P ＜0.01)，見圖1、2 和表3。

表2 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和WA/TA的比較Table 2.Changes of mPAP，mCAP，RV/(LV+S)and WA/TA in different groups(±s.n=8)

表2 各組大鼠mPAP、mCAP、RV/(LV+S)和WA/TA的比較Table 2.Changes of mPAP，mCAP，RV/(LV+S)and WA/TA in different groups(±s.n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal control group，★P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group mPAP(mmHg) mCAP(mmHg) RV/(LV+S)(%) WA/TA(%)Normal control 12.63 ±6.57 96.1 ±7.4 29.63 ±2.70 47.68 ±3.58 Hypoxia 20.88 ±3.87▲▲ 90.0 ±8.9 35.22 ±2.02▲▲ 72.62 ±5.09▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 17.40 ±7.35 86.7 ±12.5 35.95 ±4.53 63.93 ±8.70★Hypoxia+salidroside(median dose) 17.97 ±3.89 85.2 ±16.9 31.84 ±4.09★ 55.37 ±7.62★★Hypoxia+salidroside(high dose) 15.64 ±3.31★★ 86.3 ±12.5 29.04 ±2.86★★ 60.12 ±10.66★★Hypoxia+CGS－21680 14.75 ±3.77★★ 85.8 ±5.4 28.27 ±8.81★★ 54.17 ±3.44★★

Figure 1.Expression of A2aAR mRNA in pulmonary arterioles in different groups(in situ hybridization，×200).A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.圖1 各組肺細小動脈A2aAR mRNA的檢測

Figure 2.Expression of A2aAR protein in pulmonary arterioles in different groups(immunohistochemistry，×200).A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.圖2 各組肺細小動脈A2aAR蛋白的檢測

表3 各組大鼠肺細小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達的比較Table 3.Expression of A2aAR mRNA and protein in pulmonary arterioles in rats of different groups(±s.n=8)

表3 各組大鼠肺細小動脈管壁A2aAR mRNA及蛋白表達的比較Table 3.Expression of A2aAR mRNA and protein in pulmonary arterioles in rats of different groups(±s.n=8)

▲▲P ＜0.01 vs normal control group;★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group A2aAR mRNA A2a AR protein Normal control 0.113±0.010 0.045±0.008 Hypoxia 0.171±0.017▲▲ 0.135±0.080▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 0.168±0.014 0.138±0.005 Hypoxia+salidroside(median dose) 0.179±0.018 0.139±0.006 Hypoxia+salidroside(high dose) 0.200±0.031★★ 0.193±0.014★★Hypoxia+CGS－21680 0.206±0.019★★ 0.202±0.014★★

4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達的比較

低氧組肺組織A2aAR mRNA和蛋白表達顯著高于正常組(P＜0.01)，紅景天苷高劑量組和A2aAR激動劑組肺組織A2aAR mRNA和蛋白進一步高于低氧組(P ＜0.01)，見圖3、表4。

Figure 3.A2aAR protein expression in lung homogenate in different groups.±s.n=4.A:normal control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+salidroside(low dose)group;D:hypoxia+salidroside(median dose)group;E:hypoxia+salidroside(high dose)group;F:hypoxia+CGS－21680 group.▲▲P ＜0.01 vs normal control group;★★P ＜0.01 vs hypoxia group.圖3 各組肺組織勻漿A2aAR蛋白的表達

討 論

慢性低氧性肺動脈高壓的發病機制十分復雜，尚未完全明了，目前認為低氧性肺血管收縮，低氧性肺血管重建是其形成的主要原因［5］。低氧時，肺部血管舒張因子(如一氧化氮、前列環素2等)和收縮因子(如內皮素、血栓素A2、前列腺素H2等)失衡;通過一系列信號傳遞引起血管平滑細胞細胞內Ca2+增多，引起血管平滑肌收縮。導致低氧性肺血管收縮［6］。肺血管重建是缺氧肺動脈高壓的主要變化特征。近年來報道 JAK/STAT、PKC－MAPK、PI3K/PKB等多途徑參與了低氧情況下肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移［7－8］。此病理過程中，肺動脈平滑肌細胞大量增殖，從中膜遷移于內膜，主要表現為＜60 μm的無肌層肺小動脈出現明顯的肌層，＞60 μm的肺小動脈(如肌型動脈和前毛細血管動脈)中層增厚，內膜及外膜膠原及基質增生，使血管變硬，阻力增加［9］。我們的前期研究發現紅景天苷對低氧肺動脈高壓大鼠具有一定保護作用，可抑制低氧誘導的肺血管膠原增生。A2aAR在體循活化后，具有舒張血管平滑肌以及抗炎和免疫抑制作用。本文重點研究了A2aAR在紅景天苷調節大鼠低氧肺動脈高壓中的作用。

表4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達的比較Table 4.Expression of A2aAR mRNA and protein in lung homogenate in rats of different groups(±s.n=8)

表4 各組大鼠肺組織勻漿A2aAR mRNA和蛋白表達的比較Table 4.Expression of A2aAR mRNA and protein in lung homogenate in rats of different groups(±s.n=8)

▲P ＜ 0.05，▲▲ P ＜ 0.01 vs normal control group;★ P ＜0.05，★★P ＜0.01 vs hypoxia group.

Group A2aAR mRNA A2a AR protein Normal control 1.0000±0.0000 0.041±0.008 Hypoxia 1.5917±0.4776▲ 0.127±0.011▲▲Hypoxia+salidroside(low dose) 1.5226±0.6095 0.128±0.007 Hypoxia+salidroside(median dose) 1.7501±0.6756 0.131±0.011 Hypoxia+salidroside(high dose) 2.1900±0.5835★ 0.171±0.021★★Hypoxia+CGS－21680 2.2933±0.7508★ 0.173±0.008★★

1 低氧肺動脈高壓模型的復制

本研究結果顯示，常壓低氧大鼠平均肺動脈壓明顯高于正常對照組，表明4周的低氧環境已經使大鼠形成了肺動脈高壓。光鏡下，慢性低氧組大鼠炎癥細胞浸潤，肺細小動脈管壁增厚，WA/TA較正常對照組顯著增加，表明肺血管重構已經形成。此外，慢性低氧組和正常對照組相比右心指數明顯升高。這些數據表明慢性低氧性肺動脈高壓、肺血管重構及右心室肥厚模型已經建立成功。

2 A2aAR對低氧肺動脈高壓大鼠的保護作用

A2aAR在體內起著重要的擴血管、抗炎和修復的作用［10］。Thiel等［11］發現，低氧誘發 A2aAR 表達增多，抑制了急性呼吸窘迫綜合癥的發展。另外在心肌組織，低氧使A2aAR表達增加，抑制了一些炎癥介質，如 IL－6、TNF－α 等的釋放［12］。同樣，在肝組織中，低氧上調A2aAR的表達，并抑制低氧誘發的肝細胞損傷［13］。這說明在低氧刺激下，A2aAR表達量增加，可能是機體減輕低氧誘發的應激損傷的重要機制。本實驗通過免疫組化、原位雜交、real－time RT－PCR和Western blotting等方法定位和定量檢測大鼠肺血管和肺組織勻漿均發現，在低氧條件下，A2aAR表達明顯增多，這與以上研究均相符。Alchera等［14］認為低氧能夠上調A2aAR，與本實驗結果一致。我們推測，腺苷受體可能對低氧性肺動脈高壓的發展起持續的調節作用，故采用選擇性A2aAR激動劑CGS－21680。與低氧組相比，CGS－21680組大鼠A2aAR表達進一步上調的同時，肺動脈壓明顯下降，肺組織炎癥細胞浸潤減少，肺細小動脈管重構減輕，這說明A2aAR具有減輕低氧性肺動脈高壓和肺血管重建的作用。

3 紅景天苷對低氧肺動脈高壓的保護作用及機制研究。

紅景天苷是景天科植物大花紅景天的干燥根及根莖，有高原參之美譽。它主要生長在高寒地帶，具有抑制高原低氧肺動脈高壓的作用［15］。研究大鼠外周骨骼肌細胞發現，紅景天苷能夠增加一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量，并且隨著劑量的增加有上升趨勢［16］。在缺氧和炎癥反應過程中，大量胞內和胞外的腺苷通過ATP分解產生［17］。因此我們推測紅景天苷可能通過增加ATP來激活腺苷。

本實驗通過常壓低氧肺動脈高壓模型，發現低、中劑量紅景天苷有降低mPAP趨勢，但無統計學差異，高劑量紅景天苷能夠顯著降低mPAP。光鏡下我們發現紅景天苷各濃度組均能不同程度抑制慢性低氧引起的肺細小動脈管壁增厚，降低WA/TA，減少炎癥細胞浸潤，并且呈劑量依賴性。提示紅景天苷具有減輕低氧誘發的肺動脈高壓和肺血管重建的作用。

本研究通過免疫組化、原位雜交、real－time RT－PCR和Western blotting等方法發現低氧條件下，高劑量紅景天苷可使肺細小動脈和肺組織A2aAR mRNA和蛋白質水平的表達進一步升高。如前所訴，A2aAR具有擴血管、抗炎的作用。因此推測，紅景天苷可能通過增加A2aAR表達，提高機體代償極限，從而減輕低氧所誘導的肺動脈高壓和肺血管結構重構，對機體起保護作用。

［1］ Erga KS，Seubert CN，Liang HX，et al.Role of A2A－adenosine receptor activation for ATP－mediated coronary vasodilation in guinea－pig isolated heart［J］.Br J Pharmacol，2000，130(5):1065－1075.

［2］ Bender SB，Tune JD，Borbouse L，et al.Altered mechanism of adenosine－induced coronary arteriolar dilation in early－stage metabolic syndrome［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2009，234(6):683－692.

［3］ Blackburn MR，Vance CO，Morschl E，et al.Adenosine receptors and inflammation［J］.Handb Exp Pharmacol，2009，(193):215－269.

［4］ 滕靜如，熊佳鵬，肖 誠，等.紅景天的現代藥理學研究進展［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2006，12(4):319－320.

［5］ Voelkel NF，Gomez－Arroyo J，Mizuno S.COPD/emphysema:the vascular story［J］.Pulm Circ，2011，1(3):320－326.

［6］ Connolly MJ，Aaronson PI.Key role of the RhoA/Rho kinase system in pulmonary hypertension［J］.Pulm Pharmacol Ther，2011，24(1):1－14.

［7］ 姚香蘭，薛全福，趙琪平.α1－腎上腺素受體在缺氧性肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1187－1192.

［8］ 李春香，李福海，夏 偉，等.大鼠肺動脈平滑肌細胞Rho激酶對p－Smad1核遷移的作用及機制［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):443－449.

［9］ Xu MH，Gong YS，Su MS，et al.Absence of the adenosine A2Areceptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice［J］.J Vasc Res，2011，48(2):171－183.

［10］ Ohta A，Sitkovsky M.Role of G－protein－coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage［J］.Nature，2001，414(6866):916－920.

［11］ Thiel M，Chouker A，Ohta A，et al.Oxygenation inhibits the physiological tissue－protecting mechanism and thereby exacerbates acute inflammatory lung injury［J］.PLoS Biol，2005，3(6):e174.

［12］ Tan JX，Huang YG，Huang DN，et al.Effect of adenosine on activity of transcription factor NF－kappa B and cytokines in myocardial tissue of experimental rats with pneumonia［J］.Zhonghua Er Ke Za Zhi，2004，42(6):433－436.

［13］ Choukèr A，Thiel M，Lukashev D，et al.Critical role of hypoxia and A2A adenosine receptors in liver tissue－protecting physiological anti－inflammatory pathway［J］.Mol Med，2008，14(3－4):116－123.

［14］ Alchera E，Tacchini L，Imarisio C，et al.Adenosinedependent activation of hypoxia－inducible factor－1 induces late preconditioning in liver cells［J］.Hepatology，2008，48(1):230－239.

［15］ 郭 燕.紅景天對大鼠高原性肺動脈高壓的干預作用——病理形態學研究［D］.蘭州:蘭州大學，2010.

［16］ 于洪偉，季宇彬，汲晨鋒.高山紅景天苷對外周性疲勞大鼠骨骼肌細胞內ATP、AMP以及Pi含量的影響［J］.江西中醫藥，2009，40(11):59－60.

［17］ Sitkovsky MV，Lukashev D，Apasov S，et al.Physiological control of immune response and inflammatory tissue damage by hypoxia－inducible factors and adenosine A2Areceptors［J］.Annu Rev Immunol，2004，22:657－682.