Akt/GSK－3β介導高糖上調腎小管上皮細胞Snail1的表達*

余 紅， 石明雋， 肖 瑛， 劉瑞霞， 王圓圓， 郭 兵， 張國忠

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州貴陽550004)

我們前期的研究發現，在高糖培養和糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠腎小管上皮細胞中Snail1表達上調［1］，以siRNA抑制Snail1表達后，腎小管上皮細胞上皮－間充質轉化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)標志蛋白表達出現逆轉［2］。并且有研究表明Snail1在人IgA腎病和糖尿病腎病患者腎小管上皮細胞表達增多［3］，提示Snail1促進腎小管上皮細胞EMT，參與了糖尿病腎損傷的病理過程。但對DN時Snail1表達上調的機制認識還十分有限。最近研究報道，DN腎小管上皮細胞EMT過程常常伴有蛋白激酶B(Akt)和糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK－3β)的激活或異常表達［4，5］，提示它們參與了 DN 的發病機制。本研究旨在觀察Snail1、Akt和GSK－3β在高糖培養腎小管上皮細胞的表達變化，分析Akt/GSK－3β途徑與Snail1表達的關系。

材料和方法

1 材料

1.1 主要抗體和試劑 兔抗大鼠Akt1單克隆抗體、小鼠抗大鼠β－actin單克隆抗體、鏈親和素－生物素－過氧化物酶(SABC)試劑盒、生物素標記羊抗兔或羊抗小鼠IgG－HRP和兔抗羊IgG－HRP(武漢Boster);兔抗大鼠p－Akt(Ser473)多克隆抗體和ECL化學發光試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);兔抗大鼠p－GSK－3β(Ser9)多克隆抗體(Cell Signal);羊抗大鼠GSK－3β多克隆抗體和羊抗大鼠Snail1多克隆抗體(Santa Cruz);低糖DMEM培養基和胰蛋白酶(HyClone);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco);轉鐵蛋白(Sigma);LY294002(Calbiochem);總RNA提取試劑盒、蛋白質 marker、2×Taq PCR MasterMix和600 bp DNA marker(天根);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)。PVDF膜、3 mm Whatman濾紙(Millipore)。

1.2 動物 雄性SD大鼠，清潔級，鼠齡20 d，體重(40±10)g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 大鼠原代腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)的培養和鑒定 大鼠乙醚麻醉后股動脈放血處死。無菌取腎后，除去腎髓質部分，分離、剪碎腎皮質并置于80目、100目不銹鋼網篩過濾，分離腎小管節段。加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30 min，1 000 r/min離心，棄上清。加入含有10%FCS的DMEM培養液，接種于25 cm2培養瓶中。置孵育箱(37℃、5%CO2)培養。72 h后全量更換培養液，以后每2～3 d換1次培養液。第5～6 d細胞貼壁生長達瓶底面積的80% ～90%時以0.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化液消化、傳代。倒置顯微鏡觀察細胞形態和生長特性，免疫細胞化學檢測CK－18和α－SMA表達，鑒定所培養的細胞［2］。取第3代細胞實驗。

2.2 實驗分組 細胞生長融合至約90%時，換無血清DMEM培養基培養24 h，使細胞生長同步將細胞分為:(1)對照組:DMEM(含糖5.5 mmol/L)+2%FBS培養;(2)高滲組:20 mmol/L D－mannitol+DMEM+2%FBS培養;(3)高糖組:20 mmol/L D－glucose+DMEM+2%FBS培養，分別在30 min、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和 72 h 收集細胞提取蛋白和RNA;(4)LY294002抑制劑組:LY294002稀釋為 25 μmol/L，預處理細胞 50 min，再以 25 μmo/L LY294002+DMEM+2%FCS+20 mmo/L D－glucose 5 mL培養細胞24 h。24 h后收集細胞蛋白。每一實驗組均重復3次。

2.3 免疫細胞化學 細胞爬片經4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X－100打孔，3%H2O2去除內源性過氧化物酶，血清封閉后，分別加入抗 CK－18(1∶100)和抗 α－SMA(1∶200)抗體，4 ℃孵育過夜，加入生物素化Ⅱ抗，室溫下孵育40 min。DAB顯色。PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

2.4 RT－PCR 按照試劑盒說明提取原代培養腎小管上皮細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板擴增 Snail1、Akt1、GSK－3β 和 β－actin，天根公司2×Taq MasterMix試劑盒行PCR擴增。引物由上海捷瑞生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。PCR擴增條件:95℃ 5 min預變性，94℃ 45 s變性，45 s退火，70℃ 45 s延伸，72℃ 10 min總延伸。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，凝膠成像系統掃描并分析擴增產物的積分吸光度值，以目標產物/β－actin積分吸光度比值表示靶基因的相對水平。

2.5 Western blotting 加 RIPA 裂解液 100 μL，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清。BCA法測蛋白濃度，加樣緩沖液變性蛋白，上樣，SDS－PAGE凝膠垂直電泳后，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，含0.05%Tween 20 的 TBS(TBS－T)沖洗后，分別以 anti－Snail1(1∶300)、anti－Akt1(1∶200)、anti－p－Akt(1∶300)、anti－GSK－3β(1∶300)、anti－p－GSK－3β(1∶300)和anti－β－actin抗體(1∶300)與PVDF膜4℃孵育過夜。加入用含1%脫脂牛奶的TBS－T稀釋辣根過氧化物酶連接的相應Ⅱ抗，室溫孵育2 h，ECL化學發光顯影。Bio－Rad凝膠成像系統進行圖像采集和分析，以β－actin蛋白條帶作內參照，計算靶蛋白條帶與βactin蛋白條帶灰度的百分比值作為靶蛋白表達的相對水平。

表1 PCR引物序列及擴增條件Table 1.Sequences and conditions of the primers used in PCR

3 統計學處理

結 果

1 大鼠原代腎小管上皮細胞鑒定

倒置顯微鏡下可見，從培養24 h開始，卵圓形上皮樣細胞圍繞接種的腎小管節段呈島嶼狀長出，約第3～4 d形成集落，形態呈典型的多邊鵝卵石樣。經胰酶消化傳代后，腎小管上皮細胞以單個細胞貼壁并呈對數生長，符合上皮細胞生長特性。免疫細胞化學結果顯示培養的細胞胞漿CK18蛋白表達陽性，α－SMA蛋白表達陰性，說明培養細胞為腎小管上皮細胞。

2 高糖培養不同時點原代腎小管上皮細胞Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA的表達

在原代培養的RTECs，正常糖對照組Snail1和Akt1 mRNA少量表達，高糖刺激30 min即可檢測到Snail1和Akt1 mRNA表達較正常對照組明顯增多，差異顯著，并隨高糖刺激時間的延長逐漸增加。高滲組和正常糖組比較，Snail1、Akt1 mRNA表達無顯著差異。高糖刺激后GSK－3β mRNA的表達與正常糖和高滲組比較無顯著差異，見圖1。

Figure 1.Expression of Snail1，Akt1 and GSK－3β mRNA detected by RT－PCR in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(control，C)，mannitol(M)and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.*P ＜ 0.01 vs C.圖1 Snail1、Akt1和GSK－3β mRNA在不同處理組原代培養腎小管上皮細胞的表達

3 高糖培養不同時點原代腎小管上皮細胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和 p－GSK－3β蛋白的表達

Snail1蛋白在正常糖對照組腎小管上皮細胞幾乎不表達，高糖培養后Snail1蛋白隨培養時間延長而呈遞增趨勢。從高糖培養30 min起Snail1蛋白表達即較正常糖對照組顯著增加，至72 h Snail1蛋白表達雖有減少，但仍高于正常糖組。正常糖組Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白有少量表達，高糖刺激30 min始腎小管上皮細胞三者表達均顯著增多，Akt1隨刺激時間延長逐漸增加，而p－Akt和 p－GSK－3β蛋白于24 h達高峰，此后略有下降。高糖刺激對總GSK－3β蛋白表達無顯著影響。各時點高滲組 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β 和 p－GSK－3β蛋白的表達與正常糖組比較無明顯差異，見圖2。

Figure 2.Expression of Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β proteins detedted by Western blotting in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated in normal－glucose(M)，mannitol and high－glucose(HG)media at different time points.±s.n=3.#P＜0.05，*P＜0.01 vs C.圖2 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK3β和p－GSK3β蛋白在不同處理組原代培養腎小管上皮細胞的表達

4 LY294002 處理對 Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達的影響

在培養的RTECs，高糖刺激后Snail1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達明顯增加，LY294002處理組Snail1、p－Akt和p－GSK－3β表達較高糖組明顯減少。但LY294002對總Akt1和總GSK－3β蛋白的表達沒有顯著影響，見圖3。

Figure 3.Effects of LY294002，a PI3K inhibitor，on Snail1，Akt1，p－Akt，GSK－3β and p－GSK－3β protein expression in primary cultured renal tubular epithelial cells incubated with high glucose.The protein expression was examined by Western blotting assay.C:control;HG:high glucose;In:LY294002+high glucose.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs C;##P ＜0.01 vs HG.圖3 LY294002對高糖培養腎小管上皮細胞Snail1、Akt1、p－Akt、GSK－3β和p－GSK－3β蛋白表達的影響

5 相關性分析

對體外培養各組腎小管上皮細胞中Snail1蛋白與p－Akt和p－GSK－3β蛋白的表達量進行相關性分析，結果發現，Snail1蛋白表達分別和p－Akt、p－GSK－3β 蛋白表達呈正相關(r=0.794，P ＜0.01;r=0.755，P ＜0.01)。

討 論

我們利用原代腎小管上皮細胞研究高血糖引起腎臟損傷的發病機制，相對于細胞株，原代腎小管上皮細胞直接來源于機體組織，更接近和反映體內生長特性。培養的細胞經形態學和免疫細胞化學鑒定，其形態符合小管上皮細胞的特點，上皮細胞標志物CK－18蛋白表達陽性，且未見間質細胞標志蛋白α－SMA表達，證實我們分離培養的細胞為腎小管上皮細胞。研究以相同滲透壓的甘露醇為對照，排除滲透壓變化的影響，動態觀察不同培養條件和不同時點相關指標的變化與高血糖狀態的關系。

本研究發現，高糖培養30 min腎小管上皮細胞Snail1蛋白表達開始增加，至24 h時都維持于較高水平，48 h和72 h后表達有所下降，但表達量仍然明顯高于對照組。Snail1 mRNA也表現出相似的趨勢。這提示Snail1基因在正常腎組織中保持沉默，而在糖尿病時異常激活，通過蛋白表達而發揮作用。與本課題組前期的發現及其他學者的報道一致［1，3］。另外，我們還發現，高糖培養各時點腎小管上皮細胞Snail1蛋白表達上調同時伴有Akt1、p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達的增加以及Akt1 mRNA的表達增加，而高滲透壓對這些指標沒有影響。這說明，糖尿病時，引起 Snail1、Akt1、p－Akt和p－GSK－3β 蛋白或mRNA表達改變的主要原因并非高滲透壓，而是高血糖本身;高糖不僅能上調Akt1總蛋白的表達，同時還激活Akt信號分子，但高糖并不影響總GSK－3β蛋白的表達水平，只是使其功能狀態發生改變。這種改變可能是高糖激活 Akt后，進而使GSK－3β磷酸化失活的結果。

Snail1 mRNA于高糖刺激2 h開始有意義增高，晚于蛋白的增高，提示高糖引起Snail1蛋白表達上調不僅是通過轉錄水平調節，還存在其它調節機制。最近對肝細胞癌、皮膚癌等腫瘤的研究表明，Snail1的表達可能受到Akt/GSK－3β介導的翻譯后機制調節。活化的Akt能與 GSK－3β結合，誘導 GSK－3β向細胞膜轉位，磷酸化其N端的Ser9活性位點使之失活。無活性的p－GSK－3β使Snail1泛素化降解減少，核移位增加，促進EMT標志蛋白的轉錄調節［6－9］。我們觀察到，高糖誘導的腎小管上皮細胞Snail1蛋白過表達同時伴有p－Akt和p－GSK－3β蛋白表達的增加。而最近研究也報道，Akt信號分子及其下游GSK－3β磷酸化后活性改變，與TGF－β1等因素誘導的腎纖維化中腎小管EMT過程有關［10－11］。那么，在糖尿病腎間質纖維化損害中，是否Akt/GSK－3β信號通路也參與了Snail1表達的調節，進而調節EMT?我們以LY294002處理高糖培養的RTECs。LY294002為Akt上游信號分子磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)的特異性抑制劑，以往研究表明，LY294002可通過特異的競爭性抑制PI3K p110亞基的ATP結合位點而抑制PI3K的催化活性，進而抑制Akt的激活。以LY294002處理后，高糖培養的RETCs p－Akt蛋白、p－GSK－3β及Snail1蛋白表達均減少，但總Akt1和GSK－3β蛋白的表達不受影響。而且，相關性分析顯示，Snail1蛋白的表達不僅與p－Akt蛋白表達高度正相關，也與p－GSK－3β蛋白表達正相關。這一結果提示，高糖條件下，Akt可能通過PI3K依賴的方式被激活，進而使 GSK－3β磷酸化失功能，Snail1降解減少，促進了Snail1表達上調。最近Lee等［5］分別以Akt抑制劑和GSK－3β抑制劑處理高糖培養的腎小管上皮細胞，Akt抑制劑逆轉高糖引起的GSK－3β磷酸化失活，GSK－3β活性受到抑制劑抑制后，則出現Snail1蛋白的蓄積和EMT，與我們的結果相似。

綜上所述，我們推測高糖可能經Akt/GSK－3β途徑使腎小管上皮細胞Snail1蛋白水平上調。因此，DN時可能存在Akt/GSK－3β/Snail1的功能軸，通過促進腎小管上皮細胞的轉化而導致腎纖維化。

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