食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化及其mRNA表達的研究

童 強， 劉曉波△， 羅和生， 李勝保， 余宗濤， 張吉才， 高 波， 蒙建超

(湖北醫藥學院附屬太和醫院 1消化內科，3檢驗部，湖北 十堰442000;2武漢大學人民醫院消化內科，湖北武漢430060)

全世界每年大約有48萬食管癌(esophageal carcinoma，EC)新患病例，超過40萬人死于該病，主要有2種類型:好發于中上段的食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous－cell carcinoma，ESCC)及好發于食管下段1/3區域及賁門部的食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)［1］。食管癌的發生是遺傳學及表觀遺傳學共同作用的結果，表觀遺傳學研究的是基因組DNA序列未改變的情況下，基因發生可遺傳的改變并導致個體表型變化的學說。DNA甲基化是表觀遺傳學重要組成部分，不同腫瘤中DNA甲基化模式有差異［2］。對食管癌甲基化模式的探索，可以用于早期診斷、化療療效預測、預后判斷、復發及轉移的評估等［3－5］。

他扎羅汀(tazarotene)可以誘導機體產生他扎羅汀誘導基因(tazarotene－induced gene，TIG)1、2 和3［6］。TIG1 基因又名視黃酸受體應答因子－1(retinoic acid receptor responder－1，RARRES1)，集中在人類的3號染色體的短臂，位于3p12和3p13之間，其cDNA可以編碼含228個氨基酸的蛋白質，該蛋白N端的胞內區和跨膜區，以及C端胞外區含有糖基化信號［7］。在其它癌組織如胃癌、膀胱癌、前列腺癌［8－10］等中TIG1基因均發生高度甲基化，且甲基化水平明顯高于正常組織和良性增生，基因TIG1失表達與其啟動子異常甲基化密切相關。

本實驗采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(methylationspecific PCR，MSP)法及實時定量RT－PCR(real－time fluorescence quantitative PCR，FQ－PCR)檢測食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1基因的甲基化狀態及其mRNA表達水平，比較不同來源的食管組織中TIG1基因的甲基化水平，分析基因甲基化水平與mRNA表達之間的關系，以期進一步探討TIG1基因在食管癌發生、發展中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 收集湖北醫藥學院附屬太和醫院2010年2月～2011年12月間手術切除的食管癌組織43例、癌旁組織(距腫瘤邊緣2.5 cm以上)20例及15例收集自胃鏡室的食管正常組織，結果均經病理證實，標本在獲得后立即放置液氮中保存，研究中所有患者均知情同意。所有腫瘤患者術前未行放化療治療，患者年齡38～75歲，平均59.2歲，詳細資料見表1。

1.2 主要試劑和儀器 TRIzol reagent(Invitrogen);Tis－飽和酚(北京索萊寶);5－Aza－CdR和亞硫酸氫鈉(Sigma);SYBR GreenⅠ染料(Gene);Wizard DNA Clean－Up Systerm純化試劑盒和Reverse Transcription System A3500(Promega);PCR擴增試劑盒(上海生工);DNA marker(北京天根);蛋白酶K、糖原和鮭精DNA(華美);ND－2000微量核酸定量儀(NanoDrop);臺式高速冷凍離心機(日立);ABI PRISM7500(ABI);G－BOX紫外凝膠成像系統(Gene)。

1.3 引物 均由北京賽百盛生物公司合成。TIG1基因甲基化引物［11］:甲基化 M(118 bp)上游引物 5＇－GTAGTACGGGCGGGT CGC－3＇，下游引物 5＇－GACATCGCCTCCGCAACG－3＇;非甲基化 U(134 bp)上游引物 5＇－GAGGTAGTATGGGTGGGTTGT－3＇，下游引物 5＇－AATACTAAAATACAACATCACCTCCA－3＇。TIG1 mRNA［11］(134 bp)上游引物 5＇－GAAAAACCCCTTGGAAATAGTCAGC－3＇，下游引物 5＇－AGTGTGACACCTGTGTTGTCATTTCC－3＇;GAPDH mRNA［12］(226 bp)上游引物 5＇－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3＇，下游引物5＇－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3＇。

表1 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態及其相應的臨床病理特征Table 1.The methylation status of TIG1 gene in esophageal squamous－cell carcinoma tissues and its correlation with clinicopathological features

2 研究方法及步驟

2.1 DNA甲基化檢測

2.1.1 DNA的磺化修飾 以酚/氯仿法提取各食管組織的DNA，并對其行亞硫酸氫鹽修飾。修飾步驟參照［13］:檢測所提取的DNA濃度，計算4 μg DNA相應體積，用ddH2O補齊至總體積50 μL，100℃加熱10 min，立即放入冰塊內5 min，加入3.0 mol/L 的 NaOH 5.5 μL，置入 37 ℃水箱中孵化 30 min。向處理后的DNA中加入10 mmol/L的臨時配置的氫醌30 μL 和3.0 mol/L 的亞硫酸氫鈉 520 μL，輕輕混勻，加入200 μL無菌礦物油覆蓋液面，放入55℃的水浴箱內16 h。取出標本，離心后吸出無菌礦物油，將修飾后的DNA用Wizard DNA Clean－Up Systerm純化體系混勻、過柱，經脫鹽、純化回收，洗脫進50 μL的雙蒸水中。向標本中加入3 mol/L NaOH 5.5 μL，于37℃的水浴箱內15 min脫硫化基團，加入10 mol/L NH4Ac 56 μL，靜置 5 min 后，加入 5 g/L 糖原、1 μL鮭精DNA、2.5倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，將標本置入－20℃的冰箱內過夜沉淀。將標本離心，用75%預冷的乙醇洗滌2次，棄上清，得DNA沉淀，經干燥后加入30 μL的雙蒸水內溶解，于－80℃的冰箱內凍存備用。

2.1.2 MSP檢測TIG1基因的甲基化狀態 30 μL的擴增體系:DNA 3 μL，2 mmol/L dNTP 1.5 μL，10 × PCR 緩沖液 3 μL，25 mmol/L MgCl22.4 μL，上、下游引物各1.7 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.3 μL，20 × SYBR Green I 0.5 μL，ddH2O 補齊至30 μL。置于ABI PRISM7500擴增，條件為:95℃ 5 min;然后95℃ 30 s，M引物56℃ 45 s(U引物61℃)，72℃ 1 min，40個循環;72 ℃ 5 min。取 10 μL PCR 擴增產物，用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠分析儀拍照分析。

2.2 FQ－PCR法檢測TIG1mRNA的表達

2.2.1 RNA提取及cDNA的合成 按照TRIzol reagent說明書提取總RNA，以1 μg(約2 μL)總RNA作為模板，依照逆轉錄試劑盒A3500說明書配制20 μL的反應體系后放入PCR儀中，反應條件:42℃ 15 min，95℃ 5 min，而后立即放置冰塊上備用。

2.2.2 SYBR Green I FQ－PCR 將新合成的 cDNA用無RNA酶的ddH2O稀釋至100 μL，行 PCR 擴增，30 μL的擴增體系:2 mmol/L dNTP 2 μL，10 × PCR 緩沖液3 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上、下游引物各 2 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，20× SYBR Green I 0.5μL，稀釋后 cDNA 5 μL，滅菌 ddH2O 補齊至30 μL。將反應體系置于ABI PRISM7500內擴增:95℃變性5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，40個循環，最后一循環72℃時讀熒光值;72℃ 5 min，取擴增產物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統拍照分析。

2.3 TIG1 mRNA的相對定量 以GAPDH為內參照，采用實驗測定Ct值及擴增效率E，計算TIG1 mRNA的相對定量值:TIG1 mRNA/GAPDH mRNA=(1+EGAPDH)CtGAPDH/［(1+ETIG1)CtTIG1］［14］。

3 統計學處理

應用SPSS 13.0統計學軟件，基因甲基化數據處理采用χ2檢驗，當n＜40或理論頻數＜1時采用Fisher's exact test;TIG1 mRNA相對定量結果以中位數(下四分位數，上四分位數)表示，組間差異比較采用 Kruskal－Wallis檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各食管組織中TIG1基因甲基化狀態

43例食管鱗癌組織25.6%(11/43)甲基化陽性，顯著高于癌旁組織陽性率5%(1/20)(P＜0.05);正常組織中未檢測到基因甲基化(0/15)，與鱗癌組織比較差異顯著(P＜0.05)。

2 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態與患者臨床病理特征關系

如表1所示，性別、年齡、病變部位和分化程度不同的患者TIG1基因甲基化水平差異無統計學意義(P＞0.05);T1～2分期組織甲基化陽性率較T3期低，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示該基因甲基化程度與患者TNM分期有關，晚期組織樣本甲基化程度高;淋巴結轉移陽性組較陰性組陽性甲基化率高，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明組織甲基化與是否伴淋巴結轉移有關。食管鱗癌組織M及U擴增產物電泳結果見圖1。

Figure 1.Electrophoretogram of TIG1 promoter methylation status in esophageal squamous－cell carcinoma tissues.DW:double－distilled water;M:methylated primer product;U:unmethylated primer product;A:completely methylated sample;B:partially methylated sample;C:unmethylated sample.圖1 食管鱗癌組織中TIG1基因甲基化狀態電泳圖

3 食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1 mRNA缺失及相對定量比較

如表2示，鱗癌組織中TIG1 mRNA表達相對定量值顯著低于癌旁組織(P＜0.05)及正常組織(P＜0.01);癌旁組織與正常組織比較差異無統計學意義(P＞0.05)，表明2組基因表達水平相當;甲基化組顯著低于非甲基化組(P＜0.01)，表明甲基化是導致基因表達缺失重要原因。

討 論

食管癌是起源于食管黏膜的惡性腫瘤。它以基因及表觀遺傳學變化為起始，繼而多種癌基因激活、抑癌基因失活［15］，最終導致功能蛋白的下調和缺失。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學機制，主要包括啟動子區高甲基化、全部基因組低甲基化以及DNA甲基轉移酶異常表達［16］，可以參與多種重要的生命過程。包括食管癌在內的多種腫瘤均有不同程度、不同形式的DNA甲基化異常［17］。表觀遺傳學變化與組織病理學變異水平具有相關性［18］。啟動子區CpG島異常甲基化是可以抑制mRNA的轉錄，從而導致基因表達下調甚至沉默，進而引發下游事件，導致正常細胞的生長分化調控失常，這一機制與多種腫瘤的形成密切相關［19－20］。

表2 食管鱗癌組織、癌旁組織及正常組織中TIG1 mRNA表達的變化Table 2.The expression level of TIG1 mRNA in esophageal tissues，paracancerous tissues and normol tissues

TIG1蛋白有TIG1A及TIG1B兩種異構體，TIG1B可以抑制腫瘤細胞的生長與入侵能力，腫瘤組織中TIG1B的表達水平大多降低，在正常前列腺和結腸組織TIG1兩個異構體均有表達，而結腸癌細胞株中表達降低。結腸癌細胞株HCT116經轉染表達TIG1異構體使TIG1A和TIG1B均有穩定表達后，其生長顯著受抑制，表明TIG1基因及其異構體TIG1A及TIG1B可能為抑癌基因［21］。Kwol等［22］證實鼻咽癌細胞株經轉染質粒表達TIG1基因后，較TIG1表達陰性細胞株生長顯著抑制(P＜0.05)，而表達該基因的細胞株敲除TIG1基因后較未敲除的細胞增殖顯著增加(P＜0.01)，提示TIG1基因表達降低可能與鼻咽癌的發生有關。Son等［9］報道晚期胃癌TIG1表達缺失或減少較早、中期腫瘤顯著;低分化組織缺失或減少較高、中分化顯著。TIG1基因表達缺失的細胞株經去甲基化制劑5－Aza－CdR處理后，TIG1可以恢復表達或原有的表達水平提高，表明TIG1經歷頻繁的異常甲基化導致表觀遺傳學失活，它的表達變化與胃癌的進展有關。

本研究采用MSP檢測各食管組織TIG1基因甲基化狀態，鱗癌組織甲基化率為25.6%(11/43)，癌旁組織為5%(1/20)，正常組織中未檢測到基因甲基化，表明隨著組織惡性程度的增加，甲基化率增高。我們還發現鱗癌組織中TIG1基因甲基化多發生在淋巴結轉移(P＜0.05)和TNM分期晚期(P＜0.01)的患者。該結果與Mizuiri等［23］的報道有出入，可能是不同人種患者流行病學及腫瘤發病機制有差異導致，根本原因有待進一步研究證實。不同甲基化水平的基因可以作為預測腫瘤的分期及轉移的分子標記物［24］，我們推測TIG1基因甲基化不僅導致了TIG1基因的表達異常，而且與食管鱗癌的轉移相關，TIG1基因啟動子甲基化多發生在晚期腫瘤患者，提示檢測組織TIG1基因甲基化狀態可以用于患者腫瘤分期及轉移的預測因子。

基因表達定量結果顯示鱗癌組織基因表達缺失率為53.5%(23/43)，11例甲基化的標本中TIG1 mRNA表達缺失率為81.8%(9/11)，mRNA表達相對定量顯示甲基化組表達量顯著低于非甲基化組，表明TIG1基因表達缺失與其異常甲基化有關，異常甲基化導致TIG1表達失活。同時，我們還注意到鱗癌組織中非甲基化組織TIG1基因亦有不同程度的基因表達缺失，可能有可能原因為腫瘤組織中TIG1基因組DNA已發生甲基化，但尚未檢測到;另外，基因表達缺失是遺傳學及表觀遺傳學共同作用的結果，考慮DNA甲基化之外的原因引起TIG1基因表達缺失和(或)降低，有待進一步研究明確。本文證實DNA甲基化是導致抑癌基因TIG1表達降低及失活的重要原因，相信隨著研究的不斷深入，TIG1基因的重要作用以及其表達缺失在食管鱗癌發生、發展中的作用將進一步為人們所認識。

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