豬毛菜液泡膜SsNHX1基因的克隆及功能驗證

張春玉，宋 凱，高立宏，，郭立泉，李望豐，劉立俠

（1.長春職業技術學院食品與生物技術分院，吉林 長春 130033；2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024；3.長春師范學院生命科學學院，吉林 長春 130032）

土壤鹽漬化是威脅農作物生產的非生物脅迫因素之一［1］.在鹽脅迫條件下，高等植物主要是通過Na＋／H＋逆向轉運蛋白來實現Na＋外排，抗拒鹽離子毒害［2－4］.隨著人們相繼在多種植物及酵母的生物膜上觀察到Na＋／H＋逆向轉運蛋白的活性［5－6］，有關質膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白的研究受到學術界的廣泛關注.高等植物的一些鹽脅迫應答反應的分子機制與酵母細胞具有相似性，因此，利用酵母系統來分離鑒定功能保守的高等植物基因被認為是一條行之有效的快捷途徑［7－9］.

近年來，關于植物中Na＋／H＋逆向轉運蛋白的研究已有很多報道，但是關于鹽地植物豬毛菜（Salsola collina Pall）Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因的研究報道卻很少.本研究首次成功地從鹽生植物——豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因SsNHX1，并對其耐鹽能力進行了驗證，這對挖掘鹽地植物優質耐鹽基因資源具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

豬毛菜采自于吉林省西部鹽堿地區.酵母表達載體pPIC9和菌株GS115購于Invitrogen公司；克隆載體pMD18－T購于大連寶生物公司TaKaRa公司；DNA限制性內切酶，Taq酶，T4DNA連接酶，RNA PCR kit，DNA凝膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒，DNA Marker購自大連寶生物公司.PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成.

1.2 實驗方法

1.2.1 SsNHX1基因編碼區克隆

根據SsNHX1基因全序列設計引物I（含Bam HI酶切位點）和J（含Eco RI酶切位點），序列如下：

提取豬毛菜葉片RNA，通過逆轉錄獲得其cDNA，再進行PCR擴增，獲得了SsNHX1基因的編碼區序列，將之連接在pMD18－T載體上，轉化大腸桿菌，并進行鑒定及測序.將含有BamHI和EcoRI酶切位點的pMD18－T命名為pMD18－T1.

1.2.2 酵母重組表達載體pPIC－SsNHX1的構建

將含有目的基因的pMD18－T1載體和表達載體pPIC9用Bam HI和Eco RI分別進行雙酶切；試劑盒回收目的片段和載體片段，連接2h；取10μL連接產物轉化，氨芐青霉平板篩選轉化子；用Bam HI和Eco RI酶切驗證重組質粒，命名為pPIC－SsNHX1.

1.2.3 重組酵母轉化子的獲得

（1）重組載體的線性化和酵母的轉化

酶切表達載體pPIC－SsNHX1，凝膠回收目的片段；取20μL目的片段，加入100μL酵母感受態細胞，將二者混勻后，轉入電轉環，冰上放置10min，放入基因導入儀中（寧波，新芝JY－2000－1B），調節其電壓為1500V，電容為50μF，電阻為200Ω.電轉化酵母細胞7.2ms，立即加入700μL預冷的1mol／L山梨醇，混勻，混合物吸出至離心管中，30℃緩慢搖動1h；分別取100，200μL涂MD平板，充分吸干水分后，封口于30℃培養箱中倒置培養，2～3d后觀察轉化子生長情況.同時，取未轉化的酵母感受態細胞涂MD平板作負對照.

（2）重組酵母轉化子的表型鑒定

取培養在MM和MD培養基中（2～3d）的酵母轉化子（直徑3nm）觀察表型大小［9－10］.

（3）重組酵母轉化子的分子生物學鑒定

酵母重組子液體MD中30℃過夜培養，提取酵母基因組DNA，以引物1做PCR檢測.

（4）重組酵母轉化子的耐鹽實驗

將重組酵母轉化子和空白酵母共同轉到含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板上，30℃培養2～3d.計算菌落的直徑和生長速率.

2 結果和分析

2.1 酵母表達載體pPIC－SsNHX1的構建

我們從豬毛菜基因組中克隆了1700bp的SsNHX1基因編碼區全序列（兩側有Eco RI和Bam HI酶切位點），如圖1－A所示.將其連接到pMD18－T載體后進行測序，連接結果見圖1－B.用Bam HI和Eco RI將SsNHX1基因卸載下來，回收后連接到酵母表達載體pPIC9的Bam HI和Eco RI位點中，同時將酵母表達載體pPIC9的信號肽替換掉，結果見1－C.酵母表達載體pPIC－SsNHX1示意圖見圖1－D.

圖1 酵母表達載體pPIC－SsNHX1構建

2.2 重組酵母轉化子pPIC9－SsNHX1的獲得

用BglⅡ酶切重組的畢赤酵母表達載體pPIC9－SsNHX1，使其切線性化，利用電轉法將目的基因轉入到酵母基因組中獲得轉化子.由于轉化子中有組氨酸基因，而野生型的畢赤酵母GS115為組氨酸基因缺陷型，所以轉化子在不含組氨酸的選擇培養基MD上能正常生長.3d后挑取8個酵母單克隆菌落，分別挑至MM和MD培養基進行對比培養，鑒定表型.如果二者酵母菌生長相似、菌落大小差不多，說明目的片段為單點插入整合，表型為His＋Mut＋；如果在MD培養基上生長的菌落明顯比MM培養基上的大，說明基因片段為雙點替換整合，表型為His＋Muts.我們挑取的8個酵母轉化子，經過MM和MD培養基對比培養發現，從表型上看絕大部分是His＋Mut＋型，只有第4個菌落為His＋Muts型，結果如圖2所示.

圖2 豬毛菜SsNHX1酵母轉化子在MD和MM培養基上的生長表型鑒定

2.3 酵母轉化子的分子生物學鑒定

參照畢赤酵母表達手冊方法提取上述7個His＋Mut＋型酵母轉化子的總DNA，利用PCR擴增進行檢測，方法和擴增程序如前所述，結果如圖3所示.由圖3可見，7份酵母轉化子均為陽性，此結果表明外源目的基因已經成功整合到酵母GS115基因組中.

圖3 酵母轉化子的PCR鑒定結果

圖4 酵母轉化子在鹽脅迫條件下的生長情況

2.4 重組酵母轉化子的耐鹽實驗

為了驗證豬毛菜SsNHX1基因在酵母中是否能發揮耐鹽功能，30℃條件下，將4個轉化子和空白對照酵母培養在含有0.5mol／L NaCl的YPD固體平板中，培養2～3d后觀察，結果如圖4所示.從圖4我們可以看出，重組酵母轉化子的生長速率和菌落直徑均明顯高于對照，這初步表明豬毛菜SsNHX1基因能夠有效地提高酵母轉化子的耐鹽能力.

3 結論

本研究首次從鹽生植物豬毛菜中克隆了液泡膜型Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因SsNHX1（EU073422），并以酵母為表達載體，獲得了陽性轉化子.耐鹽實驗表明整合有豬毛菜SsNHX1基因的酵母在含有0.5mol／L NaCl的培養基中，與對照相比有更高的生長速率.這與濱藜液泡膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因（AgNHX1）、棉花液泡膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因（GhNHX1）和小麥液泡膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因（TaNHX1）在酵母中表達的研究結果相似［7，9，11］.這充分證明了豬毛菜液泡膜Na＋／H＋逆向轉運蛋白基因在真核生物酵母的耐鹽脅迫中起到了重要的作用.

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