東北點地梅下胚軸再生體系的建立

吳麗巍，楊 闊，陶 雙，楊文新，姜長陽

（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連116081）

東北點地梅（Androsace filiformia）又稱絲點地梅，屬于報春花科點地梅屬一年生草本植物。生長于河邊、路旁、林下、荒地、濕地等環境中，主要分布在我國的東北、內蒙古等地區，其中，在遼寧省主要分布在沈陽、鞍山、鳳城、新賓、西豐、開原、長海和桓仁等市縣[1-2]。由于點地梅類植物含有黃酮類藥用成分[3]，使東北點地梅作為中草藥使用具有清熱解毒、消腫止疼等功效，能治扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、急性結膜炎和跌打損傷等疾病[2]。近年來，遼寧地區家禽養殖專業戶發現，把東北點地梅干粉作為飼料添加劑使用，能明顯地降低家禽的發病率，提高經濟效益。于是，很多人于每年的5—6月大量地采收東北點地梅用作家禽的飼料添加劑，這使本來分布和數量就很少的東北點地梅遭到了嚴重的破壞，導致在遼寧過去有東北點地梅分布的地區，現已幾近絕跡。為保護東北點地梅的野生資源、滿足人們的需求，研究者采用組織培養的方法，對東北點地梅進行了再生體系建立的研究。雖然有關植物組織培養方面的研究很多[4-8]，并且對點地梅叢生芽繁殖技術的研究也有報道[9]，但迄今未見東北點地梅組織培養和再生體系建立研究的報道。

本研究以東北點地梅有芽下胚軸為材料，采用組織培養的方法，建立起下胚軸的再生體系。

1 材料和方法

1.1 材料來源及滅菌

6月下旬，將生長于大連市長海縣林下生長非常旺盛植株上的東北點地梅的種子采回實驗室，采用高迎秋等[10]研究東方蓼的滅菌方法進行種子滅菌，可獲得無菌種子。

1.2 培養條件

培養條件參見文獻[11]。

1.3 試驗方法

1.3.1 下胚軸愈傷組織的誘導培養 將無菌種子接種到1/2 MS培養基上，當實生苗長出一片真葉、下胚軸長0.5～0.9 cm時，在近培養基處將具有子葉和一片真葉的下胚軸剪下后，接種到以MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L為基本培養基、附加不同質量濃度的IAA，IBA和2，4-D培養基上，進行下胚軸愈傷組織的誘導培養試驗。試驗重復3次，每處理接種100個材料。

1.3.2 愈傷組織分化培養 把由下胚軸誘導培養的愈傷組織分散成4～8個顆粒組成、直徑約為0.3 cm的塊狀后，接種到以MS＋NAA 0.1 mg/L為基本培養基，附加不同濃度6-BA，ZT，KT的培養基上，進行愈傷組織的分化培養試驗。試驗重復3次，每處理接種100塊愈傷組織。

1.3.3 生根培養 向生長著繼代增殖培養叢生不定芽的培養瓶倒入7 mL質量濃度為10 mg/L的IAA溶液，處理24 h后，將不定芽從基部分割為獨立的不定芽，接種到1/2 MS培養基上，進行不定芽的生根培養。試驗重復3次，第1次接種200個不定芽，第2次接種400個不定芽，第3次接種800個不定芽。

1.3.4 試管苗移栽與定植 把3次生根培養的試管苗長勢較旺盛的植株從培養瓶中取出后，移栽到鋪著一層6～8 cm厚干凈河沙的溫室苗床上。在移栽后前10 d（濕度保持90%左右、遮陰）對成活率及長勢進行觀察統計。

把移栽成活并正常生長的1 120株試管苗，于5月上旬一次性定植到大連郊區水庫上游的草地上，按照野生條件任其生長。

2 結果及分析

2.1 不同質量濃度IAA，IBA和2，4-D對下胚軸愈傷組織誘導培養的影響

接種后56 d觀察統計，結果列于表1。

表1 不同質量濃度IAA，IBA和2，4-D對下胚軸愈傷組織誘導培養的影響

由表1可知，在附加不同質量濃度IBA的培養基上，不能誘導下胚軸生長出愈傷組織；在附加不同質量濃度IAA的培養基上，下胚軸的愈傷組織的誘導率也很低；而在附加不同質量濃度2，4-D的培養基上，下胚軸愈傷組織的誘導率效果較好。其中，在附加2.1 mg/L的2，4-D培養基上，愈傷組織的誘導生長效果最好。不僅3次重復試驗的平均誘導率達到了92.3%、半球狀愈傷組織直徑為1.6 cm，而且愈傷組織外觀長勢好。對培養過程的觀察還表明，在附加2.1 mg/L的2，4-D培養基上，培養到9 d時就有約10%的培養材料在下胚軸的下部切口處生長出直徑約為0.1 cm的淡黃色愈傷組織。之后，伴隨著愈傷組織誘導率的增加，先生長的愈傷組織也不斷地長大變綠，并且半球狀愈傷組織的表面也呈現出大小不等的顆粒狀。3次重復試驗的結果基本一致。試驗結果表明，MS＋ZT 0.2 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L＋2，4-D 2.1 mg/L是東北點地梅下胚軸愈傷組織誘導培養的理想培養基。

2.2 不同質量濃度6-BA，ZT，KT對愈傷組織分化培養的影響及不定芽的繼代增殖培養

接種培養60 d觀察統計，結果列于表2。

表2 不同質量濃度6-BA，ZT，KT對愈傷組織分化培養的影響

由表2可知，在附加不同質量濃度KT的培養基上，愈傷組織不分化；在附加不同質量濃度6-BA的培養基上，愈傷組織的分化效果較差；在附加不同質量濃度ZT的培養基上，愈傷組織的分化效果較好。其中，在附加0.6 mg/L ZT的培養基上，不僅愈傷組織分化率最高，達到92%，平均每塊愈傷組織能分化生長出5.6個不定芽，而且分化的不定芽長勢較好。對分化培養的過程觀察表明，附加0.6 mg/LZT的培養基上，培養10 d左右可見在愈傷組織塊的上面分化出不定芽點，隨后伴隨著不定芽的不斷生長，又會相繼在先分化的不定芽基部分化出多個不定芽，且分化的不定芽呈叢生狀。培養到60 d時，叢生狀不定芽就會長成高1 cm左右、外觀生長旺盛的叢生不定芽。

把這種叢生不定芽從基部切割為獨立的不定芽后，接種到相同的培養基上進行不定芽分化繼代增殖培養。3次重復試驗的結果證明，經過50 d的分化繼代增殖培養，平均1個不定芽就會分化繼代增殖培養出4.6個不定芽，并且其外觀長勢比由愈傷組織分化培養的不定芽更旺盛。試驗結果表明，MS＋NAA 0.1 mg/L＋ZT 0.6 mg/L是東北點地梅愈傷組織分化培養和不定芽的分化繼代增殖培養的理想培養基。

2.3 不定芽的生根培養

接種后30 d統計，3次重復試驗共接種的1 400個不定芽，生根株數為1 285個，平均生根率為91.8%。對生根培養過程的觀察表明，接種培養到8 d時，絕大多數不定芽可發出新根，生長為試管苗。之后，伴隨著試管苗的生長和生根率的增加，每株試管苗的根數也不斷增加。培養到30 d時，平均每株試管苗會生長出6.7條白色根，且葉片伸展、嫩綠，長勢旺盛。試驗結果表明，用10 mg/L的IAA溶液對不定芽處理24 h，將不定芽接種到1/2 MS培養基上是東北點地梅不定芽生根培養的理想方法。

2.4 試管苗移栽與定植

3次共移栽1 197株，成活了1 126株，平均成活率為94.1%。定植后30d統計，成活1103株，成活率為98.5%。定植成活的試管苗外觀生長旺盛，7月上旬開花，并保持野生東北點地梅的植物學性狀。

3 討論

本研究所定植的試管苗保持了東北點地梅的植物學性狀，表明本研究所建立的再生技術，能夠為東北點地梅野生資源的保護提供技術支撐。同時表明，采用現代無性繁殖技術，能對植物的種質資源進行保存。

在不定芽生根培養中，本研究采用10mg/L的IAA溶液對不定芽處理24 h，直接接種到1/2 MS培養基上生根的方法收到了較理想的效果，這與IAA特性和試管苗自身的合成力有關。IAA是一種植物自身合成的天然生長素，一定的質量濃度具有促進生根的作用。但是，在不定芽生根培養中，培養初期形成根原基時，需要較高質量濃度的生長素，而根伸長生長所需要的生長素質量濃度較低。而IAA這種天然生長素化學性質不穩定，在光照條件下容易分解。所以，用10 mg/L的IAA溶液對不定芽處理，使其促進形成根原基。之后，IAA的分解又有利于根原基的生長，促進試管苗的生根。實際上試管苗根的生長需要較低質量濃度的IAA，而在光照下培養的試管苗本身合成的IAA也能滿足根生長的需要。

［1］中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒：第三分冊[M].北京：科學出版社，1987：266.

［2］李書心.遼寧植物志：下冊[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1991：22-24.

［3］李承花，尹志強，黃曉君，等.點地梅的化學成分[J].中國天然藥物，2008，6（2）：123-125.

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［5］鄭純鳳，丁蓮，方晨，等.鵝絨委陵菜無性系建立及快速繁殖的研究[J].河北農業科學，2008，12（12）：569-572.

［6］于馨恒，劉兵，王春露，等.小天仙子組織培養研究[J].內蒙古農業科技，2011（3）：47-48.

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［8］李響，王建華，李鑫，等.花藺無性系建立的研究[J].河北農業科學，2011，15（3）：82-852.

［9］韓素菊，黎云祥，聶勇，等.點地梅叢芽技術研究[J].綿陽師范學院學報，2009，28（5）：67-70.

［10］高迎秋，孔祥慧，李肖依，等.東方蓼組織培養及無性系的建立[J].山西農業科學，2009，37（1）：15-18.

［11］馬素嫻，田志強，亢季萍.山西野生卷丹百合鱗莖組織培養[J].山西農業科學，2012，40（4）：319-321，377.