載脂蛋白M可能經NF-κB介導大鼠腎缺血再灌注損傷

唐 華，張春梅，陳 蓉，黃 珀，萬 英，曾維誠

(瀘州醫學院1.病理生理學教研室;2.醫學機能學實驗室，四川瀘州646000)

載脂蛋白M(apolipoprotein M，APOM)是最近發現的一種新型載脂蛋白，主要在肝細胞和腎小管上皮細胞特異性表達［1－2］。肝臟表達的APOM可能與血脂的代謝與轉運相關［3］，而腎臟表達APOM的生理意義尚不明確。肝細胞核因子1α(hepatic nuclear factor-1α，HNF-1α)、肝 X 受體(hepatic X receptor，HXR)等炎性相關轉錄因子能調節APOM在體內或體外 HepG2細胞的表達［4－7］，表明 APOM 可能參與炎性反應，但炎性反應的關鍵轉錄因子NF-кB與APOM的關系目前尚不清楚。

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)在臨床上常見于失血或中毒性休克及腎移植等，是決定移植腎存活和患者生存率的主要因素之一。據報道，由NF-кB介導的炎性級聯反應在腎IRI過程中發揮重要作用［8］。本研究采用腎缺血再灌注大鼠模型，分別從基因和蛋白水平檢測腎組織APOM的表達及NF-кB抑制劑——吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamat，PDTC)對 APOM 表達的影響，旨在探討APOM參與腎IRI的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組和標本采集

清潔級75只250～300 g雄性SD大鼠［瀘州醫學院動物實驗中心提供，合格證號:SCYK(川)2006-0004］隨機分為3組:假手術組、腎缺血再灌注模型(IRI)組和PDTC干預組(IRI+PDTC)，各組按取材時間又分為再灌注3、6、12、24和48 h組，每組5只。腎 IRI模型按常規制作［9］，PDTC 組在術前0.5 h腹腔注射PDTC(Sigma公司)100 mg/kg，假手術組和IRI組注射等量0.9%氯化鈉注射液。于再灌注各時間點再次開腹，下腔靜脈取血3 mL用于檢測血肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);同時切除左腎，分離腎皮質用于提取總RNA、胞質蛋白和核蛋白;其余腎組織常規制片，HE染色觀察腎臟病理改變。

1.2 實時熒光定量PCR檢測APOM mRNA的表達

用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA，反轉錄成cDNA。引物(上海晶美生物技術有限公司合成)如下:上游引物 5'-ACAAAGAGACCCCAGA GCCC-3'，下游引物 5'-TCCATGGTGGGAGCCG-3'，片段長度67 bp;以 β-actin為內參照，上游引物5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，下游引物 5'-CAA GAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3'，片 段 長 度 71 bp。PCR 反 應 采 用 20 μL 體 系，內 含 2 μL cDNA，22.5 pmol上游引物和下游引物，5 pmol探針，10 mmol/L dNTP 2 μL和1單位 Tag DNA聚合酶。擴增條件:95℃ 預變性1 min;95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，45個循環。反應在Light Cycler儀上進行(Roche公司生產)。采用 2－△△CT(△CT值 =CT，APOM－ CT，β-actin，△△CT值 = △CT，各處理組－△CT，假手術組)表示各組 APOM mRNA 通過 β-actin 均一化處理后相對于假手術組的表達量。

1.3 Western blot檢測APOM和NF-кB P65蛋白表達

提取的胞質蛋白和核蛋白，BCA法定量。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度6%，蛋白上樣量10 μg。泳畢，將蛋白電轉移至PVDF膜，用含5%BSA的1×TBST(1×TBS+1%Tween+5%BSA，pH 7.6)封閉過夜，加入一抗［APOM兔抗人多克隆抗體由瑞典隆德大學臨床化學研究所惠贈，稀釋濃度1∶10 000;NF-кB P65和β-actin兔抗大鼠多克隆抗體(Santacruz公司)，稀釋濃度1∶800］，37 ℃孵育2 h;加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(Santa-cruz公司，稀釋濃度1∶2 000)，37℃孵育1.5 h;以 β-actin為內參照，用ECL Plus kit(Pierce公司)進行化學發光，最后用凝膠成像系統(Bio-Rad公司)自動曝光、掃描。蛋白相對表達量 =INT'各處理組/INT'假手術組，INT'=INT目的蛋白/INTβ-actin。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 腎功能和組織學檢查

Cr和BUN水平的變化趨勢相似。IRI組各時間點Cr及BUN水平均較假手術組顯著增高(P＜0.01);而PDTC組Cr及BUN水平較IRI組明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然高于假手術組(P＜0.05)。IRI和PDTC組隨著再灌注時間的延長，Cr及BUN水平均逐漸增高(圖1)。

假手術組腎臟組織結構正常，IRI組腎臟病理變化明顯，鏡下見腎小管上皮細胞空泡變性、壞死、脫落，管腔內各種管型，腎間質炎性細胞浸潤。PDTC組腎臟病變比IRI組明顯減輕(圖2)。

2.2 腎皮質APOM mRNA的表達

假手術組有少量 APOM mRNA表達。IRI和PDTC組APOM mRNA水平均較假手術組顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，但與IRI組同一時間點比較，PDTC組各組APOM mRNA水平均明顯降低(P＜0.01)。

IRI和PDTC組APOM mRNA表達呈現出同樣的變化規律，均在再灌注3 h表達增強，于6、12 h表達緩慢下降，并在12～48 h表達再次上調(圖3)。

2.3 腎皮質APOM和NF-кB P65蛋白表達

IRI組APOM和NF-кB P65蛋白的表達均較假手術組明顯增高，PDTC組兩種蛋白的表達均比IRI組顯著降低(P＜0.01)。在IRI和PDTC組兩種蛋白的表達趨勢均呈雙峰型改變。APOM的表達高峰出現在再灌注6和48 h;而NF-кB P65的表達高峰在再灌注3和48 h(圖4)。

經檢驗，APOM mRNA與 NF-кB P65的表達符合直線正相關(r=0.852，P＜0.01)，APOM mRNA相對NF-кB P65表達的直線回歸方程擬合為y=1.687x－0.342。

3 討論

作為一種新型載脂蛋白，APOM參與脂代謝的功能正在被逐步闡明。APOM主要在肝和腎表達。在肝癌［10］及肝 IRI［11］中 APOM 表達發生明顯變化，但在腎IRI時APOM表達的變化目前尚無報道。本研究發現，IRI組各時間點腎皮質APOM mRNA表達均明顯高于假手術組，再灌注3 h表達達到高峰，6及12 h表達下調，從24～48 h表達再次增高。APOM蛋白的表達同樣呈現雙峰型改變，但表達高峰滯后于mRNA。可見，腎IRI時APOM表達發生了明顯改變，提示APOM參與了腎IRI的發病過程。

人類APOM基因位于6號染色體主要組織相容性復活體MHCⅢ區，毗鄰TNF-α和淋巴毒素基因，此區大多數基因均與免疫炎性反應有關［12］。APOM能被某些炎性反應相關轉錄因子調節，例如HNF-1α能上調HepG2細胞和活體肝癌組織APOM的表達［4－5］;而 HXR 激動劑則明顯抑制活體和體外APOM mRNA 水平［6－7］。因此，APOM 可能與炎性免疫反應有關。

NF-кB是一種快速反應的轉錄調節因子，可通過多條信號傳導通路調控多種炎性反應相關基因的轉錄，在炎性反應免疫性疾病中發揮重要作用［13］。本研究應用TFSEARCH在線分析發現APOM基因啟動子區存在類NF-кB結合位點，結合本實驗結果，NF-кB的活性改變在觀察時間內同樣呈雙峰型趨勢，于再灌注3 h達高峰，6及12 h活性下降，并于12 h直到48 h再次增高。且隨著IRI組NF-кB活性的增高，APOM的表達也顯著增高;而PDTC組伴隨NF-кB活性降低，APOM的表達也下調。APOM的表達相對NF-кB活性的直線回歸方程擬合良好，兩者的相關系數較高。提示APOM的表達變化與NF-кB的活性改變有關，其兩次高峰可能分別由IRI的應激性損傷和炎性級聯反應所致。

圖3 各組腎皮質APOM mRNA表達水平Fig 3 APOM mRNA levels in renal cortex of all groups(x ± s，n=5)

圖4 Western blot檢測各組腎皮質APOM和細胞核內NF-κB P65蛋白表達Fig 4 Expression of APOM and NF-κB P65 protein in renal cortex detected by Western blot(x ± s，n=5)

已經發現的IRI發病機制很多，其中由 NF-кB介導的炎性反應在其發病中起著重要作用。本研究初步表明，APOM可能是NF-кB的下游反應元件之一，其基因轉錄和表達受某種NF-кB信號傳導通路的調控，從而通過NF-кB調控的炎性反應，參與腎IRI的發病。NF-кB信號傳導通路是直接調控APOM的表達，還是通過間接途徑影響，還需對NF-кB與APOM基因啟動子區相應位點的結合及其具體的細胞內信號傳導途徑做進一步探討。

志謝:感謝瑞典隆德大學臨床化學研究所徐寧博士、蘇州大學附屬第三醫院張曉膺教授和綜合實驗室羅光華老師在技術上的大力支持和幫助！

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