實時熒光定量PCR技術在SPF雞四種垂直傳播疾病監測中的應用

王 靜，陳冬妮，歐芷華，袁 文，鄧慶麗，陸勇軍，張 鈺

(1.廣東省實驗動物監測所(廣東省重點實驗室)，廣州 510262;2.中山大學生命科學學院，廣州 510275)

實時熒光定量PCR技術在SPF雞四種垂直傳播疾病監測中的應用

王 靜1，陳冬妮2，歐芷華2，袁 文1，鄧慶麗2，陸勇軍2，張 鈺1

(1.廣東省實驗動物監測所(廣東省重點實驗室)，廣州 510262;2.中山大學生命科學學院，廣州 510275)

目的 探討熒光定量PCR檢測技術對SPF雞四種垂直傳播病毒的檢測應用。方法 采集60份SPF雞及70份普通雞群蛋清、泄殖腔試子樣品，提取樣品核酸，分別進行 ARV、REV、CAV、ALV四種病毒實時熒光定量PCR檢測，根據標準曲線及溶解曲線分析判讀樣品病毒拷貝數。結果 SPF雞 ALV 2份陽性，檢出率3.3%，其余病毒檢測均為陰性;普通雞樣品REV檢測2份陽性，檢出率2.9%，ALV 10份陽性，檢出率14.3%。結論 熒光定量PCR檢測方法最低可檢測到100個拷貝核酸，檢測靈敏度較高，有望應用于SPF雞臨床樣品的病原檢測。

實時熒光定量PCR;禽網狀內皮增生癥病毒;雞傳染性貧血病毒;禽白血病病毒;禽呼腸孤病毒;SPF雞

SPF雞及SPF雞胚是農業、生物醫學及生物制品研究、生產、檢驗中不可缺少的標準實驗動物和實驗材料，其質量是否達標，直接影響科研結果和實驗數據的可靠性以及生物制品產品質量。2010年版《中國獸藥典》附錄《生產、檢驗用動物標準》明確要求，用于禽類制品毒種制備與鑒定、病毒活疫苗生產與檢驗、滅活疫苗檢驗的雞和雞胚應符合國家無特定病原體(SPF級)動物標準［1］。近年來，我國獸用生物制品行業發展迅猛，企業在進行疫苗外源病毒質量控制的過程中對SPF雞(蛋)的量和質會提出愈來愈高的要求，迫切需要加快我國SPF雞的微生物學監測方法、試劑的研究。

網狀內皮細胞增生癥病毒(REV)、雞傳染性貧血病病毒(CAV)、和 J型禽白血病毒(ALV－J)、禽呼腸孤病毒(ARV)是養禽業中最常見的幾種垂直傳播的免疫抑制病毒，近年來國內流行病學調查多次報道這幾種病毒在我國養雞場中均普遍存在，且常出現多重感染［2－5］，給我國養禽業帶來了巨大的經濟損失。這些蛋傳性病毒除了會引起親代自身條件性持續性感染、免疫抑制、生產性能下降等危害之外，更嚴重的是能通過種蛋引發垂直感染，若是SPF種雞感染蛋傳性疾病，就會通過雞胚污染疫苗，更將會造成不可估量的嚴重后果，對于SPF雞生產企業來說，也是首要排除的重點病原［6］。本研究中開展對 SPF雞(蛋)威脅最大的 ARV、REV、CAV、ALV 4種蛋傳性疾病病毒的熒光定量PCR檢測技術的研究，以及檢測技術在普通雞和SPF雞群中的應用，通過對數據的分析，4種病毒的熒光定量PCR檢測技術有望應用于SPF雞病原檢測中。

1 材料和方法

1.1 樣本

廣東某SPF雞場 SPF雞泄殖腔拭子 30份，蛋清樣品30份;廣東某普通養雞場普通雞泄殖腔拭子40份，蛋清樣品30份;其中 SPF雞、普通雞均未進行4種病毒疫苗的免疫。

1.2 抗體檢測

采集 SPF雞及普通雞血清，分別進行 CAV、ARV，REV、ALV血清抗體ELISA檢測，并進行 SPF蛋清 ALV病毒 ELISA檢測，試劑盒均購自 Idex公司。

1.3 核酸抽提

CAV、REV、ALV提取病毒 DNA，泄殖腔拭子用Omega公司E.Z.N.A stool DNA kit進行提取，蛋清樣品用E.Z.N.A HP Viral DNA/RNA kit進行提取，操作按照試劑盒說明書進行。ARV提取病毒RNA，泄殖腔拭子用 Invitrogen公司 Trizol進行 RNA抽提，操作按照試劑說明書進行。

1.4 cDNA制備

糞便及蛋清樣品提取病毒RNA進行反轉錄，反應體系:5×primerScript buffer 2 μL，PrimerScript RT enzyme mixI 0.5 μL，oligo dT 25 pmol，random 6 mers 50 pmol，total RNA 6～7 μL，H2O up to 10 μL;反應程序:37℃ 20 min，85℃ 5 s。反轉錄試劑盒購置 Takara 公司，PrimerScript RT reagent kit。

1.5 四種病毒SYBR green熒光定量PCR引物設計合成

參照Genbank中登錄的相應毒株序列 ARV 1133株s1基因(Gene ID:13310185);REV LTR片段序列(GI:57865344);ALV gag基因片段(GI:308053557);CAVvp2基因片段序列(GI:299474029)，通過軟件 Primer 5.0設計熒光定量PCR引物。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

利用前述報道建立的四種病毒實時熒光定量PCR方法進行檢測。

1.6.1 ARV熒光定量 PCR檢測:標準品:取 pTARV標準質粒進行梯度稀釋，以2.1×106到2.1×102copy 6個梯度稀釋度的質粒作為定量標準曲線。每一個梯度2個復孔;陰性對照3個復孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清cDNA。SYBG QPCR體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各 0.4 μL，模板 cDNA 2 μL，SYBR green master mix 12.5 μL，總體系25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機進行 PCR反應，反應程序:95℃ 10 min，1 cycle;95℃ 5 s，57.5℃ 10 s，72℃ 31 s，45 cycles;55℃～95℃ 讀取溶解曲線。QPCR試劑盒為Roche公司FastStart SYBR green master(ROX)，熒光定量PCR儀為ABI 7500。

1.6.2 REV熒光定量 PCR檢測:標準品:取 pTREV質粒進行梯度稀釋，以5.2×106到5.2×102這6個梯度稀釋度的質粒作為標準品進行熒光定量PCR，每一個梯度采用2個復孔，陰性對照3個復孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清樣品DNA進行REV前病毒DNA的熒光定量PCR檢測。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各0.4 μL，模 板 DNA 2 μL，SYBR green master mix12.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機進行PCR反應，反應程序:95℃，10 min 1 cycle;95℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 31 s，45 cycle;55℃～95℃讀取溶解曲線。

1.6.3 ALV熒光定量 PCR檢測:標準品:取 pTALV質粒進行梯度稀釋，以1.9×106到1.9×102這6個梯度稀釋度的質粒作為標準品進行熒光定量PCR，每個梯度2復孔，陰性對照3個復孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清提取樣品DNA進行ALV前病毒 DNA的熒光定量 PCR檢測。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各0.4 μL，模 板 DNA 2 μL，SYBR green master mix 13.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機進行PCR反應，反應程序:酶活化95℃，10 min;變性 95℃ 10 s，退火 50℃ 10 s，延伸 72℃ 31 s;50℃～95℃讀取溶解曲線。

1.6.4 CAV臨床樣品熒光定量PCR檢測:標準品:取pT－CAV質粒進行梯度稀釋，以1.1×107到1.1×102這6個梯度稀釋度的質粒作為標準品，進行熒光定量PCR，每一個梯度采用2個復孔，設置陰性對照3個復孔。樣品:SPF雞及普通雞糞便及蛋清樣品DNA。SYBG QPCR 體系:ddH2O 9.5 μL，上下游引物(SYBR)各 0.4 μL，模板 DNA 或 cDNA 2 μL，SYBR green master mix 12.5 μL，總體系 25 μL。冰上混勻，稍微離心。上機進行PCR反應，反應程序:酶活化94℃，10 min;變性 94℃ 10 s，退火 59℃ 15 s，延伸72℃ 31 s;50℃～95℃讀取溶解曲線。

1.7 數據統計分析

根據標準品定量做出標準曲線結合溶解曲線進行樣品分析，樣品Ct值位于定量可信區間且Tm值與標準品一致的判為可疑，復檢確認。Ct值大于定量標準品最低拷貝數Ct值以后的判為陰性，

2 結果與分析

2.1 ELISA檢測結果

40份 SPF 雞血清 CAV、REV、ARV、ALV－J抗體檢測均為陰性，30份SPF蛋清樣品ALV抗原檢測均為陰性;52份普通雞血清抗體檢測結果為:CAV陽性率 82.7%(43/52)、REV 23.1%(12/40)、ARV 100%(52/52)、ALV－J 9.6%(5/52);30 份普通雞蛋ALV病原檢測陽性率7%(2/30)。

2.2 ARV熒光定量PCR檢測結果與分析

根據標準質粒pT－ARV拷貝數做出標準曲線(圖1.1，1.3)，標準曲線在 2.1× 106到 2.1×102拷貝范圍內呈現良好的線性關系。相關系數為r2為0.999，擴增效率約為 103%，檢測下限為210個拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品Ct值均落于陰性區，拷貝數都＜2.1×102，溶解曲線分析也為陰性。(圖1.1，1.2)。普通雞的泄殖腔拭子和蛋清液樣品的Ct值均落于陰性區，拷貝數都 ＜2.1×102，溶解曲線分析也為陰性(圖1.3，1.4)。

圖1.1 SPF雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:pT－ARV質?？截悢狄来?.1×106到2.1×101，樣品Ct值均落在陰性區間。Y=－3.23X+35.86，R2=0.999Fig.1.1 Quantitative real－time standard curve of pT－ARVplasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－ARV plasmid from 2.1×106to 2.1×101copies/μL were tested to generate a standard curve:y=－3.23X+35.86，R2=0.999.The Ct values of samples were all below the detection threshold

圖1.2 SPF雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－ARV的溶解曲線對應單一溶解峰，Tm值在78.4℃;陰性對照對應平緩的線條，樣品孔均為Tm值不同的溶解峰。Fig.1.2 Melting curve analysis of pT－ARV plasmid and SPF chicken samples.Tm of stanrdard pT－ARV plasmid was 78.4℃.The melting curves of SPF chicken samples exhibited nonspecific melting peaks.

圖1.3 普通雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:pT－ARV質?？截悢狄来螢?.1×106到 2.1× 102，y=－3.33X+36.92，R2=0.99，樣品Ct值均落在陰性區間。Fig.1.3 Quantitative real－time standard curve of pT－ARV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－ARV plasmid from 2.1×106to 2.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:y=－3.33X+36.92，R2=0.99.The Ct values of samples were all below the detection threshold.

圖1.4 普通雞樣品ARV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－ARV標準品對應單一溶解峰，Tm值78.4℃;陰性對照對應平緩的線條，部分樣品有非特異溶解峰。Fig.1.4 Melting curve analysis of pT－ARV plasmid and common chicken samples.Tm of stanrdard pT－ARV plasmid was 78.4℃.The fluorescence melting curves of common chicken samples showed non－specific melting peaks.

2.3 REV熒光定量PCR檢測結果與分析

根據標準質粒pT－REV拷貝數做出標準曲線進行樣品分析(圖2.1、2.3、2.5)，標準曲線在5.2×106到5.2×102拷貝范圍內呈現良好的線性關系。相關系數為r2為0.993～0.995，擴增效率約為97%～98%。檢測下限為520個拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品REV前病毒DNA拷貝數都低于檢測下限，部分樣品Ct值落在定量范圍內，但溶解曲線分析為非特異擴增。(圖2.1，2.2);40份普通雞的泄殖腔拭子和30份蛋清液樣品REV前病毒DNA拷貝數大部分都低于520拷貝，溶解曲線分析，樣品出現非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測孔，初步篩選出來的陽性可疑樣品3份。3份可疑陽性樣品再次實驗確認2份為陽性(圖2.3～2.6)。

圖2.1 SPF樣品REV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:標準品pT－REV質?？截悢狄来?.2×106到 5.2×102，Y=－3.398X+35.983，R2=0.995.Fig.2.1 Quantitative real－time standard curve of pT－REV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－REV plasmid from 5.2×106to 5.2×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.398X+35.983，，R2=0.995.

圖2.2 SPF雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:pT－REV標準品對應單一溶解峰，Tm值79.6℃;樣品出現非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測孔，未發現陽性孔。Fig.2.2 Melting curve analysis of pT－REV plasmid and SPF chicken samples.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃.The fluorescence melting curve of SPF chicken samples showed non－specific melting peaks.

圖2.3 普通雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:標準品pT－REV質粒拷貝數依次5.2×106到5.2×102，部分樣品孔落在檢測區間。Fig.2.3 Quantitative real－time standard curve of pT－REV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－REV plasmid from 5.2×106to 5.2×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Some samples＇Ct values were located within the detection range.

圖2.4 普通雞樣品REV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在79.6℃;樣品出現非特異溶解峰。排除Tm值及溶解曲線異常檢測孔，初步篩選出來的陽性可疑樣品3份。Fig.2.4 Melting curve analysis of pT－REV plasmid and common chicken samples.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃.Three samples displayed the same Tm peak with that of standard plasmid，and were regarded as suspicious samples.

圖2.5 普通雞REV可疑樣品再次熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:標準品拷貝數依次5.2×106到5.2×102，可疑結果仍有兩份樣品結果陽性。Y=－3.36X+35.159，R2=0.993Fig.2.5 Confirmation by QPCR detection of suspicious samples.pT－ARV plasmids were serially diluted from 5.2×106to 5.2×102copies/μL to obtain quantitative standard curve:Y=－3.36X+35.159，R2=0.993.There were still 2 suspicious samples which showed positive results.

圖2.6 普通雞樣品REV可疑樣品再次熒光定量PCR溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在79.6℃;樣品有低拷貝特異峰和雜峰。Fig.2.6 The melting curves of suspicious samples tested by QPCR detection.Tm of standard pT－REV plasmid was 79.6℃，2 samples with the same melting curve of standard plasmid，and the others were non－sense noisy.

2.4 ALV熒光定量PCR檢測結果與分析

根據標準質粒pT－ALV拷貝數做出標準曲線進行樣品分析(圖3.1、3.3、3.5)，標準曲線在 1.9×106到1.9×102拷貝范圍內呈現良好的線性關系。相關系數為 r2約為0.999，擴增效率約為98%～102%。檢測下限為190個拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品中ALV前DNA拷貝數大部分都小于190，3份樣品Ct值落在定量范圍內。溶解曲線分析其2份可疑樣品出現與標準品一致的單一溶解峰，1份為非特異雜峰(圖3.1～3.2)。30份普通雞的泄殖腔拭子和40份蛋清液大部分樣品ALV前DNA拷貝數都小于190，大部分樣品Ct值均落于陰性區，14份樣品Ct值落在定量范圍內;大部分樣品出現非特異溶解峰，排除兩份Tm值不同樣品，12份可疑樣品出現與標準品一致的單一溶解峰或出現雜峰(圖3.3，3.4)，17份可疑樣品進行重復實驗，12份可疑樣品出現與標準品一致的單一溶解峰，拷貝數在 199～326之間，判為陽性。(圖3.5，3.6)。

圖3.1 SPF雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:質?？截悢狄来?.9×106到1.9×102。3份樣品Ct值落在定量范圍內。Y=－3.3797X+36.9035，R2=0.999Fig.3.1 Quantitative real－time PCR standard curve of pT－ALV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－ALV plasmid from 1.9×106to 1.9×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.3797X+36.9035，R2=0.999.＇The Ct values of three samples were within the detected range.

圖3.2 SPF雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR5份可疑樣品溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;2份可疑樣品孔出現與標準品孔一致的單一溶解峰，1份出現雜峰。Fig.3.2 Melting curve analysis of pT－ALV plasmid and SPF chicken samples.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃.Two samples displayed the same Tm peak with that of standard plasmid，were regarded as suspicious samples，and the others showed to be non－specific melting curves.

圖3.3 普通雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:質?？截悢狄来?.6×106到7.6×101，14份樣品拷貝數大于檢測最低拷貝數 190。Y=－3.2649X+37.1308，R2=0.998。Fig.3.3 Quantitative real－time standard curve of pT－ALV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－ALV plasmid from 7.6×106to 7.6×101copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.2649X+37.1308，R2=0.998，and the Ct values of 14 samples were located within the detection range.

圖3.4 普通雞樣品ALV(SYBR)熒光定量PCR 14份可疑樣品溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;排除兩份Tm值不同樣品孔，12份可疑樣品出現與標準品一致的單一溶解鋒或出現雜峰。Fig.3.4 Melting curve analysis of pT－ALV plasmid and common chicken samples.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃.There were 12 suspicious samples showing the same Tm with that of standard plasmid except 2 non－specific melting curves.

圖3.5 SPF及普通雞ALV 17份可疑樣品DNA再次熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:標準品拷貝數依次7.6×106到7.6×102，4份樣品低于檢測最低拷貝數190。Y=－3.2803X+37.1187，R2=0.991。Fig.3.5 Confirmation by QPCR detection of suspicious samples.pT－ALV plasmids were serially diluted from 7.6×106to 7.6×102copies/μL to obtain quantitative standard curve:Y=－3.2803X+37.1187，R2=0.991.There were still 13 samples in the suspicious samples which showed positive results.

圖3.6 SPF及普通雞ALV 17份可疑樣品再次熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在82.1℃;12份可疑樣品孔出現與標準品孔一致的單一溶解峰。5份為非特異雜峰，排除。Fig.3.6 The melting curves of suspicious samples were tested by QPCR detection.Tm of standard pT－ALV plasmid was 82.1℃，12 samples with the same melting curves of standard plasmid，and the other 5 samples were non－specific melting curves.

2.5 CAV熒光定量PCR檢測結果及分析

根據標準質粒pT－CAV拷貝數做出標準曲線進行樣品分析(圖3.1、3.3、3.5)，標準曲線在 1.1×107到1.1×102拷貝范圍內呈現良好的線性關系。相關系數為r2約為0.998～0.999之間，擴增效率約為86%～94%。檢測下限為110個拷貝。30份SPF雞的泄殖腔拭子，30份蛋清液樣品的拷貝數小于檢測下限110，且溶解曲線分析均為無意義噪音或直線，CAV檢測均為陰性(圖4.1，4.2)。30份普通雞的泄殖腔拭子和30份普通雞蛋清液樣品的拷貝數都小于檢測下限110，且溶解曲線分析均為無意義噪音或直線，CAV檢測均為陰性(圖4.3，4.4)

2.6 ELISA檢測方法與qPCR檢測方法的比較

SPF雞的4種病毒抗體檢出率為0，說明 SPF雞未感染4種病毒。然而，普通雞樣品都能檢出4種病毒抗體，檢出率分別是 ARV 100%，CAV 82.7%，REV 23.1%，ALV 9.6%，說明普通雞已感染4種病毒。QPCR檢測病原方法，4種病毒在SPF雞中僅ALV檢2/60份陽性，檢出率3.3%，其余病毒檢測均為陰性，而普通雞場樣品 REV檢測2/70份陽性，檢出率 2.9%，ALV 10/70份陽性，檢出率14.3%。

3 討論

3.1 ALV、CAV、REV、ARV 的感染特征

ALV是一群逆轉錄病毒，具有多種亞型。其中A、B、C、D亞型主要在蛋雞引發淋巴樣腫瘤，J亞型主要在肉雞引發骨髓細胞瘤，但近年來在蛋雞中的發生率也在上升。各種年齡雞均可感染ALV發病，患病雞極度消瘦，生長發育不良，免疫反應低下，產蛋率下降，死亡率高。ALV感染前期雖不產生明顯可見腫瘤，但可誘發雞群的免疫抑制狀態，引起感染雞只消瘦，產蛋下降等問題，還會導致不同程度的繼發感染。CAV感染特征是導致雛雞的全身淋巴組織萎縮和再生障礙性貧血，并伴隨免疫抑制，是一種既能垂直感染又能橫向感染的病毒，垂直感染的雛雞一般表現為急性臨床癥狀，水平傳播感染的雛雞表現為亞臨床癥狀，成年雞能感染CAV病毒，而且排毒，但不表現臨床癥狀，產蛋量、受精率、孵化率等均無明顯影響。ARV一些毒株可引發雛雞的病毒性關節炎，多數毒株可能只是表現消化道功能紊亂、羽毛生長差，生長緩慢等亞臨床癥狀，但可造成不同程度的免疫抑制，特別是垂直感染的雛雞，易導致并發或繼發其他疾病。REV是反轉錄病毒科病毒，感染后引起以網狀細胞增生為主要特征的綜合征。REV可水平傳播，也可垂直傳播。一般感染低日齡雞，特別是新孵出的雛雞及胚胎，感染后引起嚴重的免疫抑制或免疫耐受［6，7］。近年來REV、ALV、CAV、ARV這四種垂直傳播病原在種雞業中的發生率有上升的趨勢，這類病毒不僅能通過水平接觸傳播，而且還可通過種蛋垂直傳播而將疫情擴大，感染雞群常常表現為亞臨床形式，并造成不同程度的免疫抑制，導致免疫失敗從而給生產帶來損失，而使用攜帶了病原的SPF雞胚生產的疫苗更有可能導致種雞接種后商品代的感染，危害被放大，導致嚴重的經濟損失。因此及時檢出和淘汰病雞對控制這類疾病具有重大意義。

圖4.1 SPF雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:質粒拷貝數依次1.1×107到1.1×102，樣品Ct值均落在不可信區間，遠低于最低拷貝數，判斷為陰性。Y=－3.70X+38.11，R2=0.998Fig.4.1 Quantitative real－time standard curve of pT－CAV plasmid and quantitative plot of SPF chicken samples.Serial dilutions of pT－CAV plasmid from 1.1×107to 1.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.70X+38.11，R2=0.998.The Ct value of samples were all below the detection threshold.

圖4.2 SPF雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在79.9℃附近;樣品孔均為無意義噪音或直線。Fig.4.2 Melting curve analysis of pT－CAV plasmid and SPF chicken samples.The Tm of standard pT－CAV plasmid was 79.9℃.The melting curves of all SPF chicken samples demonstrated as non－specific melting peaks.

圖4.3 普通雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR標準曲線及樣品定量圖:質?？截悢狄来?.1×106到1.1×102，樣品Ct值均落在陰性范圍。Y=－3.47X+35.59，R2=0.999。Fig.4.3 Quantitative real－time standard curve of pT－CAV plasmid and quantitative plot of common chicken samples.Serial dilutions of pT－CAV plasmid from 1.1×106to 1.1×102copies/μL were tested to generate a standard curve:Y=－3.47X+35.59，R2=0.999.The Ct values of samples were all below the detection threshold.

圖4.4 普通雞樣品CAV(SYBR)熒光定量PCR溶解曲線圖:標準品溶解曲線對應單一溶解峰，Tm集中在80.3℃;樣品孔為低拷貝無意噪音或直線。Fig.4.4 Melting curve analysis of pT－CAV plasmid and common chicken samples.The Tm of standard pT－CAV plasmid was 80.3℃ .The melting curves of common chicken samples demonstrated as non－specific melting peaks.

3.2 實時熒光定量PCR(qPCR)

既保持了 PCR技術靈敏、快速、特異的特點，又克服了以往PCR技術中存在的假陽性及不能進行準確定量等缺點，近年來在基礎研究及臨床應用方面發揮著越來越大的作用。禽網狀內皮增生癥病毒、雞傳染性貧血病毒、禽白血病病毒、禽呼腸孤病毒這四種蛋傳性病毒引起的疫病在我國雞群中普遍存在，對于SPF雞及雞胚生產單位來說尤其需要及早地準確診斷才能避免病毒垂直傳播造成的進一步擴散污染。本文中所建立的四種雞蛋傳性病毒qPCR檢測方法，能夠檢測到最低100個拷貝的病原量，比普通PCR的檢測靈敏度提高了1個數量級，并首次將其應用于SPF雞生產企業的疾病監測。在臨床檢測應用顯示 SPF雞 ARV、CAV和REV病毒均未檢出，ALV檢出率為2/60;普通雞群ARV和 CAV病毒未能檢出，REV檢出率為2/70，ALV檢出10/70，這些陽性感染樣品的病毒拷貝數集中在100～500個之間，而且SPF雞群體的陽性率及病毒拷貝數要遠遠低于普通雞群，說明4種病毒的qPCR檢測方法能應用于臨床樣品的病原檢測。

3.3 從ARV和CAV的血清抗體檢測

結果可以看出，普通雞群感染了該病毒并產生了廣泛的高抗體，這時可能存在病原的消失，應用qPCR方法不能檢測到病原。REV、ALV感染雞在群體中只有部分產生抗體，qPCR方法檢測病原和ELISA方法檢測抗體均有陽性結果，本研究中，ELISA抗體檢測SPF雞樣品結果均為陰性，而qPCR檢測方法檢出兩份 ALV陽性，但是，我們建立的方法還不能有效區分內源性和外源性ALV，病原檢出率明顯高于ELISA方法，因此，ALV－qPCR的檢測方法還需要進一步優化，同時擴大檢測樣本量，與ELISA－Ab檢測方法的聯合使用進一步提高檢測結果的準確性。

3.4 血清學抗體檢測

血清學抗體檢測能為動物群體是否污染病原微生物提供依據，SPF雞是在屏障環境下隔離飼養、繁育的實驗動物群體，血清抗體檢測背景較低，結果大多為陰性結果，臨床商品化ELISA檢測試劑應用于SPF雞血清抗體檢測是否存在檢測靈敏度不夠的缺陷，對于生物制品原材料的 SPF雞胚來說，SPF種蛋中攜帶病原的檢測尤為重要，因此僅僅采用血清學檢測方法來判斷SPF雞的微生物攜帶狀況是不夠的，應采取定期棉拭子采樣、蛋清樣品檢測病毒核酸的方法來提高針對SPF雞攜帶病原微生物的檢測靈敏度。本研究中檢測到的陽性樣本病毒核酸拷貝數在100到500個拷貝之間，說明本檢測方法靈敏度較高，有望應用于SPF雞臨床樣品的病原檢測。

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Application of SYBR Green Fluorescent Quantitative Real-Time PCR in the Detection of Four Vertical Transmission Viruses in SPF Chickens

WANG Jing1，CHENG Dong－ni2，OU Zhi－hua2，YUAN Wen1，DEN Qing－li2，LU Yong－jun2ZHANG Yu1
(1.Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute，Guangzhou 510620，China 2.School of Life Sciences，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510275)

Objective To apply SYBR green I fluorescent quantitative real－time PCR(QPCR)in detecting 4 vertical transmission viruses of chicken and to evaluate its application value for the quality control of SPF chickens.Method Quantitative real－time PCR technique was used to detect REV，ALV，ARV and CAV RNA，DNA or provirus DNA in 30 cloacal swab samples and 30 eggs of SPF chicken samples as well as 40 cloacal swab samples and 30 eggs of common chicken samples.Standard curve and melting curve analyses were conducted to obtain the quantitative result.Results Out of the SPF chicken samples，2/30(3.3%)were ALV－positive，and the three other viruses were negative.For the common chicken samples，2/70(2.9%)were REV－positive，and 10/70(14.3%)were ALV－positive.Conclusions These QPCR assays show better sensitivity and specificity for detecting the 4 viruses in SPF chickens with a detection limit of 100 copies of target DNA per－reaction，and have a bright prospect in clinical application.

Quantitative real－time PCR(QPCR);Reticuloendotheliosis virus(REV);Chicken infectious anemia virus(CAV);Avian leukemia viruses(ALV);Avian reovirus(ARV);SPF chicken

R33

A

1671－7856(2012)08－0006－09

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.002

2012－06－10

廣東省教育部產學研結合項目(2008B090500205)，廣東省實驗動物重點實驗室(2007B060101002)聯合資助。

王靜，女，助理研究員，研究方向實驗動物遺傳、分子生物學研究。

張鈺，高級工程師。E－mail:zhangyugzh@hotmail.com。