犬瘟熱病毒RT-LAMP檢測方法的建立和初步應用

溫 海，秦海斌，賀星亮，朱 騫，高一龍，張匯東

(公安部南京警犬研究所分子生物學實驗室，南京210012)

犬瘟熱病毒RT-LAMP檢測方法的建立和初步應用

溫 海，秦海斌，賀星亮，朱 騫，高一龍，張匯東

(公安部南京警犬研究所分子生物學實驗室，南京210012)

目的 利用環介導等溫擴增(LAMP)技術建立一種檢測犬瘟熱病毒感染的新方法。方法 根據GenBank中NP基因序列，設計4條LAMP特異性引物，對反應條件、特異性、可視化效果和應用效果進行研究。結果 在60℃等溫的條件下、1 h內可完成RT-LAMP擴增過程;特異性和可視效果良好;對63份臨床標本進行檢測，陽性檢出率為71.4%(45/63)，檢出率高于RT-PCR的63.5%(40/63)。結論 建立的RT-LAMP檢測方法，顯示了較高的特異性和敏感性，而且兼具高效、快捷、可視化的優勢，為臨床檢測犬瘟熱病毒感染提供了一種快速簡便的新途徑。

環介導等溫擴增;犬瘟熱病毒;檢測

犬瘟熱(canine distemper disease，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，可引起大批食肉目動物的發病和死亡，死亡率高達30%～80%，其自然宿主包括犬科動物(犬、狼、豺、狐等)，鼬科動物(貂、臭鼬、黃鼠狼等)，浣熊科動物(浣熊、小熊貓、大熊貓等)，還可感染靈長類動物(如日本獼猴等)［1］，近年來隨著生態環境改變和病毒的進化，CDV自然感染的宿主范圍正在不斷擴大［2］，已經出現人感染 CDV的報道［3］。犬瘟熱病毒的常用檢測方法包括病毒分離、病理組織包涵體檢查、血清學檢測、核酸探針、原位雜交、膠體金快速診斷試紙條和RT-PCR等方法［3，4］，其中膠體金快速診斷試紙條和 RT-PCR在臨床診斷中的應用最為廣泛，但是近幾年研究表明，試紙條的假陰性和假陽性比例很高、準確性較差，RT-PCR受樣本、RNA降解等因素的影響，檢出率遠未達到理想水平，因此，為適應臨床檢測對準確性和可操作性的更高要求，我們應用環介導的等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立了 CDV的反轉錄－環介導等溫擴增(RT-LAMP)快速診斷方法，進一步提高了對 CDV的檢出率、準確性，增強了臨床實踐中及時、準確地檢測犬瘟熱病毒的能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要毒株和細胞:CDV-Onderstepoort株，由公安部南京警犬研究所分子生物學實驗室保存;63份待檢樣本(結膜分泌物23份、鼻拭子18份、死亡肺臟15，血清7份)，采集自南京和山東地區疑似CDV感染犬或水貂;非洲綠猴腎細胞(Vero)購自中國獸藥監察所.

1.1.2 主要試劑:10×ThermoPol反應緩沖液、BstDNA聚合酶(8 U/μL)購自 New England BioLabs公司;5.0mmol/L Betaine購自 Sigma-Aldrich公司;dNTP mixture、AMV 酶(5 U/μL)、TaqDNA 聚合酶、DNA/RNA提取試劑盒均為TaKaRa公司產品。

1.2 引物的設計與合成

根據GenBank中登錄的犬瘟熱病毒基因序列，用在線軟件 PrimerExplorerversion 4(http://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)在 NP 基因保守區域篩選4條RT-LAMP引物(表1)，引物由上海皓佳生物技術有限公司合成。

1.3 RT-LAMP檢測方法的建立

1.3.1 RNA模板的制備:RNA采用TaKaRa RNA提取試劑盒進行提取，立即進行RT-LAMP反應。

1.3.2 RT-LAMP檢測體系:LAMP反應總體積25 μL，內含引物 BIP 和 FIP 各 1 μL(40 pmol)、F3 和B3 各 0.5 μL(10 pmol)、2.5 μL 10× ThermoPol反應緩沖液［200mmol/L Tris-HCI，100mmol/L KCI，20mmol/L MgSO4，100mmol/L(NH4)2SO4，1.0%Tween 20］、4.0 μL 5.0mmol/L Betaine、4.0 μL 2.5mmol/L dNTPs mixture、8 U Bst DNA polymerise、2 μL 模板 RNA;1μL AMV(5 U/μL)，0.5 μL RNA 酶抑制劑(40 U/μL)，2μL RNA 模板，ddH2O 補足體積到 25 μL。體系在 60℃、63℃ 和 65℃ 孵育 30、45和60 min，孵育反應結束后，再在80℃作用10 min終止反應。根據反應產物的量選擇合適的擴增條件。

1.3.2 LAMP特異性鑒定:提取CPIV GN株、CDV GN株和正常 F81細胞培養產物的RNA，于上述選擇的適宜循環參數下進行 RT-LAMP擴增，判斷其特異性。

1.3.3 LAMP結果可視化效果檢測:分別以 CDV GN株和蒸餾水作為陽性和陰性對照，對63份臨床樣本在最佳LAMP條件下進行檢測，以瓊脂糖凝膠電泳結果為參照，觀察SYBR green I染色的可視化效果。瓊脂糖凝膠電泳:10 μL LAMP產物，以1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，成像、觀察。SYBR green I染色:按照1∶100的比例向 LAMP反應管中加入 SYBR green I，靜置觀察。

1.4 與RT-PCR診斷方法的比較和應用

對63份臨床送檢的不同種類的病料應用RTLAMP、RT-PCR［5］方法進行檢測，比較兩者的符合率和檢出率的高低，初步判定RT-LAMP方法臨床使用效果。

表1 RT-LAMP引物序列Tab.1 Sequence of each primer for CDV RT-LAMP

2 結果

2.1 RT-LAMP檢測方法的建立

以CDV GN株DNA為模板，分別以60℃、63℃和65℃反應60 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，顯示在60℃時該實驗的條帶清晰、分辨率較高(圖1)。在60℃，分別反應30 min、45 min和60 min，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，表明在45 min、60 min即可實現擴增，本實驗選擇60 min以提高反應的靈敏度(圖2)。

圖1 CDV GN株的RT－LAMP反應在不同溫度的擴增結果M.DNA 標準 DL 2 000;1.65℃;2.63℃;3.60℃ .Fig.1 RT-LAMP products amplified at different temperaturesM.DNA marker DL2000;1.65℃;2.63℃;3.60℃.

圖2 CDV GN株的RT－LAMP反應在不同時間的擴增結果M.DNA標準 DL2000;1.60min;2.45min;3.30min;4.陰性對照Fig.2 RT-LAMP products amplified at different time pointsM.DNA marker DL2000;1.60 min;2.45 min;3.30 min;4.Negative control

2.2 RT-LAMP反應特異性試驗

分別以CDV GN株、CPIV GN株和蒸餾水對照DNA為模板，在60℃反應60 min，產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，CDV對照的陽性條帶明顯，CPIV GN株和蒸餾水對照均未出現準確條帶，表明RT-LAMP反應特異 (圖3)

圖3 CDV RT-LAMP反應的特異性擴增結果M.DNA標準DL2000;1.陰性對照;2.CPIV GN株;3.CDV GN株.M.DNA標準 DL2000;Fig.3 RT-LAMP specific amplified products of CDV1.negative control;2.CPIV GN strain;3.CDV GN strain

2.3 RT-LAMP方法的可視化效果

LAMP反應結束后在產物內加入1∶100稀釋的SYBR Green I，肉眼可見CDV RT-LAMP反應陽性管顏色變綠，而陰性對照管顏色仍為橙黃色，顏色變化明顯。對63份臨床樣本進行檢測，SYBR Green I染色判定的陽性檢出率和陰性檢出率與電泳法相比符合率均為100%，可視化判定操作簡單、效果良好。此方法可作為RT-LAMP方法現場檢測的判定標準，不必經過電泳、凝膠成像等繁瑣的步驟和儀器。

2.4 RT-LAMP方法的應用結果

對63份疑似CDV感染的病料進行RT-PCR和RT-LAMP檢測，RT-PCR總體檢出率為(40/63)63.5%，RT-LAMP方法的陽性檢出率為(45/63)71.4%;其中，對23份結膜拭子和7份血清樣品，兩種方法的檢測結果完全相同，18份肺臟樣品 RTPCR檢測出8份陽性，RT-LAMP方法檢測出12份陽性，15份鼻拭子中RT-PCR檢測出7份陽性，RTLAMP方法檢測出8份陽性。說明 RT-LAMP方法的檢出率更高，不易出現假陰性結果(表2)。

表2 CDV RT-LAMP方法和RT-PCR方法的應用比較Tab.2 Comparison between RT-LAMP and RT-PCR in clinical diagnosis

3 討論

近年來，CDV的自然感染宿主已由傳統的犬科(Canidae family)、鼬科(Mustelidae family)及浣熊科(Procyonidae family)擴展到了食肉目(Carnivora oder)所有8個科及偶蹄目豬科(Suidae family)、靈長目獼猴屬(Macaca Lacepede)和鰭足目海豹科(Phocidae family)等多種動物，并且免疫動物爆發犬瘟熱的病例在世界多個國家和地區都有報道。這些日趨復雜的臨床癥狀給CDV的診斷帶來一定難度。僅根據流行病學、臨床癥狀、包涵體檢查和病毒分離等常規方法很難確診CDV感染。因此國內外許多學者建立了 RT-PCR、巢式 PCR、套式 PCR、原位雜交、原位雜交與RT-PCR結合等多種分子生物學檢測方法，但是對于CDV而言，不同種類、不同病理階段的檢測材料對檢測結果的影響存在在很大差異，上述各種檢測方法在應用中均有其不足之處。Doo KIM等應用RT-PCR方法對人工感染犬在不同病理時期采集的樣本進行了檢測效果的評價，證實不同時期采集的外周血、結膜拭子、鼻拭子、尿液的檢出率差別很大，在攻毒后連續采樣20 d中，前2 d采集的鼻拭子和外周血中檢測不到CDV，前5 d內采集的尿液中檢測不出CDV，而結膜拭子從第1天到第20天均能達到100%的檢出率(7/7)，證實了采樣部位和采樣時機對RT-PCR結果的重要影響［6］。Frisk等基于 NP基因設計了 3對不同引物，研究不同引物對的檢出率的影響，在29個病毒陽性病例中，三對引物的檢出率分別為82%、53%、41%，分析認為RT-PCR的敏感性受到所選引物的影響，取決于擴增片段的位置，而且由于病程和發病類型的不同病毒的分布會有很大差異，同樣會影響檢測結果。因此，在一個病例中選擇多種樣本(血清、外周血、鼻拭子、腦脊髓液)或者采取不同時間的多個樣本同時進行檢測能夠顯著提高檢測的準確性［7］。

無論是檢材種類的不同、采樣時間的差別、還是RNA降解的影響，犬瘟熱病毒檢測時存在假陰性的一個重要原因，是受到檢測方法本身靈敏度的限制，導致當病毒(或其RNA)低于某個限量的時不能檢出。要進一步提高CDV的檢測準確性，就必需采用具備更高靈敏度核酸檢測技術。環介導的等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近些年開發的一種簡單、迅速、特異且具成本效益的新的核酸擴增技術［8］，它利用4條不同引物識別6個不同區域的靶基因，在恒溫條件(約60～65)0C能夠通過一步反應在15 min～60 min內將DNA擴增109～1010倍，其靈敏度被證明是常規PCR 的 10－100 倍［9－12］。鑒于 LAMP 技術在靈敏度上的優勢，本文建立了檢測犬瘟熱病毒的RTLAMP方法，經體系優化后，證實該方法可在60℃等溫的條件下、1 h內完成擴增，且對感染犬類的其他病毒不出現非特異性反應;對63份臨床可疑樣本的檢測結果證明，該RT-LAMP方法陽性檢出率高于RT-PCR方法，能夠減少的臨床檢測中假陰性的比例;另外，與常規PCR方法相比，LAMP技術獨特的可視化的結果判定方法和檢測時間上的優勢，也大大增加了將之應用于現場檢測的前景。但與其高超的靈敏度相對應，LAMP方法的假陽性也是一個爭論的焦點，尤其檢測大批量樣本時陽性產物產生的氣溶膠是造成假陽性的重要原因，在本文中由于臨床送檢樣本中內容物有限，不足以對陽性樣本進行假陽性驗證，因此僅對水貂肺臟樣本進行了免疫組織化學檢測(另文發表)，證實了LAMP檢測陽性而RT-PCR陰性的5份病料中可見典型的犬瘟熱病毒核內包涵體，之所以RT-PCR檢測陰性，可能是病料運送過程較長或者大量的內源性RNA酶在RNA提取過程中導致了核酸的降解，超出了RT-PCR方法的檢測下限，這在相關研究已有提及［6］。

綜上，本研究針對犬瘟熱病毒建立的RT-LAMP檢測方法，靈敏、迅速、特異性強，無需使用昂貴的儀器設備，具備可視化判定結果的能力，可作為一種高效檢測CDV的手段，廣泛應用于CDV的診斷和流行病學調查等相關研究。

［1］Soma T， Ishii H， Hara M， et al. Comparison of immunoperoxidase plaque staining and neutralizing tests for canine distemper virus［J］.Vet Res Commun，2001，25(4):311－325.

［2］Appe IMJ，Yates RA，Foley GL，at al. Canine distemper epizootic in lions，tigers，and leopards in North America［J］.J Vet Diagn Invest，1994.6:277－288.

［3］Hoyland JA，Dixon JA，Berry JL，et al.A comparison of in situhybridization，reverse transcripitase-polymerase chain reaction(RT-PCR)and in situ-RT-PCR for detection of canine distemper virus RNA in Paget’s disease［J］.J Virol Methods，2003.109(2):253－259.

［4］Jozwik A，Frymus T.Comparison of the immunofluorescence assay with RT-PCR and nested PCR in the diagnosis of canine distemper［J］.Vet Res Commun，2005，29(4):347－359.

［5］肖定福，張匯東，李文平，等.RT-PCR檢測寵物犬的犬瘟熱病毒［J］.經濟動物學報，2005，9(4):221－224.

［6］Frisk AL，Konig M，Moritz A，at al.Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum，whole blood，and cerebrospinal fluid from dogs with distemper［J］.J Clin Microbiol，1999，37:3634－3643.

［7］Doo KIM，Jeoung SY，So-Jeo AHN，at al.Comparison of tissue and fluid samples for the early detection of canine distemper virus in experimentally infected dogs［J］.J.Vet Med Sci，2006，68(8):877－879.

［8］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et.al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res，2000，28(12):E63.

［9］Cho HS，Kang JI，Park NY.Detection of canine parvovirus in fecal samples using loop-mediated isothermal amplification［J］.J Vet Diagn Invest，2006，18(1):81－84.

［10］Imai M，Ninomiya A，Minekawa H.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed in fluenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method［J］.Vaccine，2006，24(44－46):6679－6682.

［11］Poon LL，Wong BW，Ma EH，et.al.Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loopmediated isothermal amplification［J］.Clin Chem，2006，52(2):303－306.

［12］Pham HM， Nakajima C， Ohashi K， et al. Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Newcastle disease virus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(4):1646－1650.

Detection of Canine Distemper Virus by Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification Method

WEN Hai，QIN Hai-bin，HE Xing-liang，ZHU Qian，GAO Yi-long，ZHANG Hui-dong
(Nanjing Policedog Research Institute of MPS，Nanjing 210012，China)

Objective To develop a new method for rapid detection of canine distemper virus by reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification method(RT-LAMP).Method According to the published GenBank sequence，four strips of primers specific recognizing NP gene of canine distemper virus were designed.We studied the optimal reaction conditions，specificity，sensitivity，and its visualized judging method of products.Then we used 63 clinical specimens to verify its efficiency in field detection.Results The amplication can be performed at a constant temperature 60℃ within 1 hour.Specific primers did not recognize genes of other virus commonly infecting canine.The results of RTLAMP could be easily observed by naked eyes after SYBR green I staining.In 63 specimens collected from Nanjing and Shangdong，45 samples(71.4%)were positive，but only 40 samples(63.5%)were positive using RT-PCR.Conclusion The results of our study demonstrate a higher superiority of specificity，sensitivity，efficiency and convenience of the RTLAMP method，and provide a new detection method for canine distemper virus.

RT-LAMP;canine distemper virus，CDV

S852.65+5;S858.292;R33

A

1671-7856(2012)08-0051-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.008.012

2012-05-24

公安部應用創新計劃(2007YYCXNJJQS161)。

溫海(1961－)，男，副研究員，從事動物疫病防控工作。E-mail:hingull@sina.com。

張匯東，研究員，E-mail:zhhuido@163.com。