黑曲霉固態(tài)發(fā)酵菊芋粉產(chǎn)菊粉酶的工藝條件優(yōu)化研究

王麗威，鄭彥山，陳科偉，宋秀潔

（遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新123000）

黑曲霉固態(tài)發(fā)酵菊芋粉產(chǎn)菊粉酶的工藝條件優(yōu)化研究

王麗威，鄭彥山，陳科偉，宋秀潔

（遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新123000）

為提高菊粉酶活力，降低成本，研究了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵菊芋粉產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，初始pH、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)菊粉酶活力的影響均顯著，優(yōu)化后的發(fā)酵工藝參數(shù)麩皮28%，菊芋粉12%，（NH4）H2PO40.5%，玉米漿1%，按固液比4∶6加水，初始pH為7.0，接種量3%，35℃培養(yǎng)6d，所得的菊粉酶活力最高，達(dá)158U/g，為菊粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。

菊粉，菊粉酶，黑曲霉，菊芋，固態(tài)發(fā)酵

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑曲霉（Aspergillus niger）A4 分離于菊芋塊莖周?chē)寥溃?jīng)EMS化學(xué)誘變和紫外誘變，察氏斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱中保藏，實(shí)驗(yàn)時(shí)將保存的菌種接種于斜面活化培養(yǎng)基，于30℃恒溫培養(yǎng)3d，如此連續(xù)活化3次。用活化的菌種制作孢子懸液，接種于種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)6d，制成孢子濃度約為2×109cfu/mL的種子液，作為發(fā)酵用菌種；酶反應(yīng)底物的配制3.00%菊糖溶液：稱(chēng)取菊糖（sigma公司）3.0g溶于80mL醋酸－醋酸鈉緩沖液（0.05mol/L、pH4.5），置于磁力攪拌器上加熱溶解，冷卻攪拌過(guò)夜，用緩沖液定容至100mL，4℃貯存?zhèn)溆茫ú怀^(guò)7d）；3.00%蔗糖溶液：配制方法同 3.00%菊糖溶液；DNS（3，5 Dinitrosalicylic Acid）試劑 參考文獻(xiàn)［9］進(jìn)行配制和使用；粗酶液的制備 發(fā)酵結(jié)束后，按培養(yǎng)基∶水= 1∶8（m/v）的比例加入去離子水，在渦旋混合器振蕩30min，10℃下5000r/min離心10min，取上清，制成粗酶液，4℃保存；菊芋 產(chǎn)于阜新農(nóng)業(yè)園區(qū)實(shí)驗(yàn)田，3月下旬采收，去皮，切成約2mm厚的薄片，于80℃烘干磨粉，過(guò)40目篩，保藏備用，經(jīng)測(cè)定，菊糖含量為51.2%；斜面活化培養(yǎng)基 察氏培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基 麩皮與水質(zhì)量比1∶1混合，拌勻，以10g/瓶分裝于250mL錐形瓶中，121℃，滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)基麩皮和菊芋粉占40%，按固液比4∶6加水，其它按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種的活化和種子培養(yǎng)方法 將黑曲霉菌種接種于斜面活化培養(yǎng)基中，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至孢子長(zhǎng)滿(mǎn)斜面（約3～4d），再次轉(zhuǎn)接，如此連續(xù)活化培養(yǎng)3次。將活化好的菌種轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3d，加入無(wú)菌水和已滅菌的玻璃珠，在渦旋混合器上充分振蕩，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為7.0×107個(gè)/mL。吸取1mL孢子懸液接種于10g種子培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天搖曲一次，防止培養(yǎng)基板結(jié)粘連。待種子培養(yǎng)基上布滿(mǎn)孢子（約6d）時(shí)，表示種子已經(jīng)生長(zhǎng)成熟。再按上述操作方法，制成孢子懸液，用作種子液。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基按10g/瓶（以濕重計(jì)）分裝于250mL錐形瓶中，110℃滅菌20min后冷卻，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的比例接種一定量的種子液，搖勻，置于30℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，每天搖曲一次。發(fā)酵的前2d按1mL/10g補(bǔ)加無(wú)菌水。

1.3 菊粉酶活力的測(cè)定［3］

3，5－二硝基水楊酸（DNS）比色法：將粗酶液適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄊ蛊湓谒馇€(xiàn)的線(xiàn)性范圍內(nèi)）后取0.2mL，加入2mL 3%底物，55℃恒溫水浴中反應(yīng)10min滅活。然后加入1.5mL 3，5－二硝基水楊酸試劑，沸水浴反應(yīng)5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻，再用去離子水定量至25mL，混勻，測(cè)定540nm下吸光度值OD540。在相同條件下，以加入失活的酶液作對(duì)照。通過(guò)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=4.9814x－0.0062求得還原糖含量。菊粉酶活力定義為：以菊粉為底物，每分鐘轉(zhuǎn)化生成1!mol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)以菊芋粉和麩皮為基本原料，研究了碳源、氮源、接種量、發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的影響。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的影響。采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 麩皮與菊芋粉添加比例對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活力的影響 發(fā)酵過(guò)程中，菊糖起到產(chǎn)酶底物的作用。有研究結(jié)果表明，菊粉酶的產(chǎn)生具有一定的誘導(dǎo)性，但同時(shí)也受阻遏效應(yīng)的影響［2，5，8］。麩皮作為一種天然物質(zhì)，不但能為黑曲霉發(fā)酵提供碳源和能源及其它營(yíng)養(yǎng)因子，還起到載體的作用。因此，二者的比例對(duì)菊粉酶活力具有重要影響。由于實(shí)驗(yàn)采用的菊芋粉中含有51.2%的菊糖，而一般液態(tài)發(fā)酵菊粉酶菊糖含量在2%～8%之間，因此實(shí)驗(yàn)中考慮到固態(tài)發(fā)酵原料轉(zhuǎn)化率問(wèn)題，將發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮和菊芋粉總量設(shè)置為40%，麩皮與菊芋粉比例分別設(shè)置為24∶16、28∶12、32∶8、36∶4，其它條件為：硫酸銨1%，pH6.5，接種量3%，30℃恒溫箱中培養(yǎng)6d。所得結(jié)果如圖1。

圖1 麩皮與菊芋粉添加比例對(duì)菊粉酶活力的影響

由圖1可知，隨著菊芋粉在總固體基質(zhì)中所占比例增加，菊粉酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)麩皮與菊芋粉比例為28∶12時(shí)，即麩皮添加量為28%，菊芋粉添加量為12%時(shí)，即菊糖含量6%左右，菊粉酶活力最高。

2.1.2 氮源對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活力的影響 大量的研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的氮源對(duì)產(chǎn)酶影響很大。研究以麩皮和菊芋粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（麩皮28%，菊芋粉12%，pH為6.5），添加不同氮源，按3%接種量接種，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)6d，測(cè)定菊粉酶活力，結(jié)果如表1。由表1可以看出，有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更利于產(chǎn)酶，復(fù)合氮源比單個(gè)有機(jī)或無(wú)機(jī)氮作用強(qiáng)。這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮屬快速氮源，發(fā)酵初期菌體能快速吸收利用無(wú)機(jī)氮進(jìn)行大量生長(zhǎng)繁殖，而蛋白質(zhì)類(lèi)有機(jī)氮經(jīng)過(guò)菌體蛋白酶分解后產(chǎn)生的多肽、氨基酸又可直接被吸收利用，利于菌體生長(zhǎng)和酶合成。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的影響 發(fā)酵過(guò)程中，隨著菌體的生長(zhǎng)繁殖，酶活力也發(fā)生相應(yīng)的變化。發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮 28%，菊芋粉 12%，（NH4）H2PO40.5%，玉米漿 1%，pH6.5，滅菌后，按3%接種量接種，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8d，每隔1d測(cè)定菊粉酶活力，結(jié)果如圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菊粉酶活力呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6d時(shí)，菊粉酶活力達(dá)到最高。6d后菊粉酶活力開(kāi)始下降，可能是由于黑曲霉產(chǎn)酶代謝過(guò)程中產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，特別是一些酸類(lèi)物質(zhì)，使得體系酸度升高，菌體開(kāi)始衰老。

表1 不同氮源對(duì)菊粉酶活力的影響

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菊粉酶活力的影響

2.1.4 初始pH對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活力的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮28%，菊芋粉12%，（NH4）H2PO40.5%，玉米漿1%，調(diào)節(jié)pH，滅菌后，按3%接種量接種，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，測(cè)定菊粉酶活力，結(jié)果如圖3。隨著pH的提高，菊粉酶活力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)初始pH為6.5時(shí)達(dá)到最高。這表明偏酸性的條件利于黑曲霉產(chǎn)菊粉酶。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)的酸度發(fā)生了較大的變化，發(fā)酵3d后pH甚至降到3.0，這非常不利于產(chǎn)酶，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加緩沖鹽類(lèi)或碳酸鈣來(lái)維持一定的酸度。

圖3 不同初始pH對(duì)菊粉酶活力的影響

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活力的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮28%，菊芋粉12%，（NH4）H2PO40.5%，玉米漿1%，pH為6.5，按3%接種量接種，分別置于不同溫度下培養(yǎng)6d，測(cè)定菊粉酶活力，結(jié)果如圖4。由圖4可見(jiàn)，35℃時(shí)菊粉酶活力最高，這說(shuō)明黑曲霉固體發(fā)酵菊粉需要在較高溫度下進(jìn)行。這可能是由于固體發(fā)酵基質(zhì)含水量低，需要在較高的溫度下才能維持一定的傳質(zhì)效率，進(jìn)而促進(jìn)酶的合成。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菊粉酶活力的影響

2.1.6 接種量對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基與2.1.5中所用的相同，分別按不同接種量接種，于35℃恒溫箱中培養(yǎng)6d，測(cè)定菊粉酶活力，結(jié)果如圖5。由圖5可以看出，隨著接種量的增加，菊粉酶活力逐漸提高，當(dāng)接種量為3%時(shí)達(dá)到最高，但當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí)，菊粉酶活力反而降低。這是因?yàn)榻臃N量較小時(shí)，菌體繁殖量少，酶的產(chǎn)量也少；當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，菌體繁殖速度過(guò)快，大量分解菊糖，產(chǎn)生較多的降解物造成分解代謝阻遏，產(chǎn)酶量減少。

圖5 不同接種量對(duì)菊粉酶活力的影響

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

發(fā)酵培養(yǎng)基成分與2.1.5中所用的相同，選取初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度作為發(fā)酵工藝條件正交實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素，結(jié)果如表2和表3。

表2 發(fā)酵工藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9（34）

由極差、方差分析可以看出，初始pH（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和發(fā)酵溫度（C）三個(gè)因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)菊粉酶活力的影響均顯著，其影響主次順序?yàn)锽＞A＞C，發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)水平組合為B2A3C3，即初始pH為7.0，發(fā)酵時(shí)間為6d，培養(yǎng)溫度為35℃。由于該組合在正交實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明，采用該工藝條件發(fā)酵菊粉酶活力達(dá)158U/g。

表3 方差分析表

3 結(jié)論

以菊芋粉、麩皮為主要基料，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到了黑曲霉Aspergillus niger A4固態(tài)發(fā)酵菊粉酶的最佳條件：麩皮28%，菊芋粉12%，（NH4）H2PO40.5%，玉米漿1%，按固液比4∶6加水，初始pH為7.0，按3%接種，35℃，培養(yǎng)6d，所得菊粉酶活力最高，達(dá)158U/g。實(shí)驗(yàn)采用菊芋粉為主要原料，既節(jié)約了菊糖提取帶來(lái)的成本，又充分發(fā)揮了菊芋中碳源、氮源、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分作用，得到了菊粉酶活力較高培養(yǎng)方法，為菊粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一條有效途徑。

［1］鄭文竹，姚炳新，魏文鈴，等.從菊芋制備菊粉精液的方法和菊芋干片成分分析［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1996，35（1）：112－115.

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Optimization of solid－state fermentation conditions with Jerusalem artichoke powder for production of inulinase by Aspergillus niger

WANG Li－wei，ZHENG Yan－shan，CHEN Ke－wei，SONG Xiu－jie
（College of Science，Liaoning Technology University，F(xiàn)uxin 123000，China）

To obtain inulinase with high activity and low cost，optimization of medium composition and fermentation conditions for the production of inulinase by Aspergillus niger A4 was investigated in solid－state fermentation using orthogonal experimental designs.The results showed that with solid－state fermentation method，when the fermentation temperature was 35℃，wheat bran 28%，Jerusalem artichoke powder 12%，the initial pH7.0，inoculum 3%，（NH4）H2PO40.5%，corn steep 1%，fermentation time 6d，the enzyme activity was up to 158U/g solid medium，which was much higher than that reported in the literature using liquid fermentation.

inulin；inulinase；Aspergillus niger；Jerusalem artichoke；solid－state fermentation

TS201.3

A

1002－0306（2010）12－0202－04

菊芋，學(xué)名 Jerusalem artichoke（Helianthus tubeuosus），為菊科向日葵屬多年生草本植物，地下形成塊莖。由于菊芋具有耐旱、耐寒、繁殖力強(qiáng)、易于栽培等特點(diǎn)，使其分布很廣。近年來(lái)，許多地方將其種植在沙地、荒坡、海灘等貧瘠的土地上，用于防風(fēng)固沙、保持水土和改良土壤。據(jù)測(cè)定菊芋干片中含菊粉54.07%，蛋白質(zhì)8.86%，脂肪1.45%，粗纖維3.56%，灰分3.6%，水分8.39%［1］。菊芋塊莖中的菊粉（又稱(chēng)菊糖，inulin）是繼淀粉之后的“第二代糖源”。其化學(xué)本質(zhì)是以β－2，1－糖苷鍵連接的果糖多聚物，聚合度（DP）一般為2～60。菊粉酶（Inulinase，E.C.3.2.1.7），是一種菊糖水解酶，按照其作用的方式分為外切菊粉酶（Exo－inulinase）和內(nèi)切菊粉酶（Endo－inulinase）。研究發(fā)現(xiàn)，能產(chǎn)生菊粉酶的微生物包括曲霉屬、青霉屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、桿菌屬、鐮孢屬、踝節(jié)菌屬、畢赤酵母屬、Chrysosporium屬、節(jié)桿菌、假單胞菌、黃假單胞菌、婁徹氏鏈霉菌、隱球酵母菌、毛殼霉［2－8］等的微生物，其中以曲霉屬及青霉屬微生物所產(chǎn)酶的活力為最高，黑曲霉（Aspergillius niger）作為工業(yè)酶制劑生產(chǎn)的傳統(tǒng)經(jīng)典菌種，得到了許多研究者的重視。菊粉經(jīng)過(guò)降解可以生產(chǎn)果糖和低聚果糖，作為食用或飼用添加劑，也可以通過(guò)進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)酒精、有機(jī)酸等產(chǎn)品。從九十年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)有一些單位進(jìn)行了菊粉酶的研究，主要采用液態(tài)發(fā)酵法。在國(guó)外，諾維信（Novozyme）公司率先開(kāi)發(fā)出Fructozyme，具有內(nèi)切酶和外切酶活性，可用來(lái)水解菊粉，但是價(jià)格較高。比利時(shí)的Ofrati公司采用內(nèi)切菊粉酶降解來(lái)源于菊苣的菊粉生產(chǎn)低聚果糖。由于固態(tài)發(fā)酵具有節(jié)能、節(jié)水、環(huán)保等優(yōu)越性，因此在酶制劑、酒精、有機(jī)酸等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵菊芋粉生產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為菊粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

2009－11－10

王麗威（1977－），女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)。

校級(jí)青年基金（07A138）。