基因導入途徑與腦內表達的關系研究

趙浩 李運軍 陳立華 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

基因導入途徑與腦內表達的關系研究

趙浩 李運軍 陳立華 魏群 戴宜武 徐如祥 王任直

目的比較不同途徑(股靜脈、頸內動脈、側腦室及鞘內)導入轉鐵蛋白靶向脂質體介導的LacZ基因(transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes，Tf-PLs)在大鼠腦內的表達，尋找出適合臨床的安全有效的基因導入方法。方法120只雄性SD大鼠隨機分為靜脈導入組、動脈導入組、側腦室導入組、鞘內注射組和治療組，其中治療組分別將Tf-LacZ通過股靜脈、頸內動脈、側腦室立體定向及鞘內的方式注射入大鼠體內。術后24和48h分別取腦(每項檢測指標每組隨機選取8只大鼠)，光學顯微鏡下觀察LacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶(beta-gal)的表達，Real time-PCR比較不同組別LacZ mRNA的表達，試劑盒檢測β-半乳糖苷酶的活性。結果免疫組化提示動脈導入組及靜脈導入組可以實現β-半乳糖苷酶在腦內的廣泛性表達，并且動脈導入組LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表達高于靜脈組(P＜0．05)。側腦室及鞘內注射組只能實現β-半乳糖苷酶的局限性表達，且LacZ mRNA及β-半乳糖苷酶的表達要低于動脈及靜脈導入組(P＜0．05)。結論動脈導入將外源基因轉入大鼠腦內的效果最好，靜脈導入的效果優于側腦室注射和鞘內注射的方式。在可行性方面，經過靜脈導入途徑是較為方便、易行、有效。

脂質體轉鐵蛋白血腦屏障轉運途徑

血腦屏障(BBB)是一層將腦組織和血液系統分隔開的物理屏障，其基本結構成分是單層腦毛細血管內皮細胞及其相互間的緊密連接。在正常生理情況下只允許分子質量＜600Da的脂溶性低分子通過，這一特性對于維持大腦內環境的相對穩定十分重要，但同時也使超過95%以上的治療藥物，尤其是最近發展很快的高分子生物藥物如神經營養因子、多聚寡核苷酸、抗體等無法通過血腦屏障到達腦部發揮作用，成為中樞神經系統疾病治療的瓶頸。因此跨血腦屏障的藥物轉運研究成為當前腦類疾病治療的重點。在我們本項研究中，我們選取了可以與血腦屏障表達的轉鐵蛋白受體相結合的轉鐵蛋白靶向脂質體，將其包裹外源基因LacZ后，通過4種不同的方式注射至大鼠體內，通過比較外源基因在大鼠腦內的表達情況，篩選出一種較為方便、快捷、有效的外源基因導入方法。

材料與方法

1．試劑:pCMV-LacZ質粒由本實驗室保存，GFAP-LacZ質粒由上海吉凱基因公司合成;膽固醇氯甲酸酯(購自上海晶純試劑有限公司);N，N-二甲基乙二胺(購自日照力德士化工有限公司)、轉鐵蛋白(Transferin，Tf，購自Sigma公司)、2-亞氨氫氯化硫醇Traut's試劑盒(購自PIERCE公司);DSPEPEG-MAL、POPC、DSPE-PEG2000、DSPE(購自Creative PEGWorks);PicoGreen核酸定量試劑盒、NanoOrange蛋白定量試劑盒(購自Invitrogen公司);瓊脂糖Sepharose CL-4B、葡聚糖Sephadex G-25(購自北京/東凱生物);質粒大提試劑盒Maxiprep(購自Qiagen，Chatworth，CA);LacZ Dectction Kit for Tissues(購自Invivogen公司)，RNeasy Mini試劑盒和Beta-Glo Assay System試劑盒(購自Promega公司)，BCA蛋白檢測試劑盒(Piece公司)。

2．儀器:燒瓶、夾熱套、攪拌器、Cary Eclipse熒光分光光度計、SENCO旋轉蒸發器(上海申生科技有限公司)、LGJO．5冷凍干燥機(北京四環科學儀器廠)、KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、VORTEX-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，ABI7900HT定量PCR儀等。

3．實驗動物:200～250g SPF級SD雄性大鼠120只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。無菌手術在北京協和醫學動物實驗中心屏障動物實驗設施進行［SYXK(京)2005-0008］，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。將Tf-PLs分別通過股靜脈、頸內動脈、側腦室立體定向、鞘內注射4種方式注射入大鼠體內，并設立對照組作為參照。

4．轉鐵蛋白靶向脂質體的制備:pGFAP啟動子啟動的LacZ表達質粒pGFAP-LacZ質粒的構建與提純送上海吉凱基因化學技術有限公司合成構建。將33mmol/L的DC-膽固醇、33mmol/L的POPC(25．971mg/ml)、1．65mmol/L的DSPE -PEG2000(5．61mg/ml)、0．33mmol/L的DSPE-PEG-MAL (1．122mg/ml)各385μl混合后，室溫旋轉蒸干溶劑，加入4ml二氯甲烷復溶后加入1ml(200μg/ml)質粒水溶液，渦旋振蕩5min，超聲5min，30℃旋轉蒸干氯仿，得到包裹pGFAP-LacZ質粒的脂質體。利用Traut's試劑盒，將Tf的氨基末端活化，連接至脂質體的聚乙二醇長鏈末端，構建Tf-PLs。

5．組織化學染色:每組8只動物分別于藥物注射后48h處死，用0．01mol/L的PBS和4%多聚甲醛以先快后慢的速度行心臟灌注。取腦置于4%多聚甲醛中固定過夜，再分次浸泡于10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水至組織沉底。OCT膠包埋組織于恒冷冷凍切片機切片，切片厚度為12μm，每2張切片間隔70μm，鋪片于DEPC處理過的載玻片。將X-gal染色液滴加到切片上，孵箱中37℃孵育2～4h后封片鏡檢。

6．Real time PCR:藥物注射24h后每組8只大鼠過量麻醉處死，斷頭取腦及周圍器官，迅速放入凍存管液氮中保存。提取各組腦組織總RNA并通過RNeasy Mini試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，設計上下游PCR引物，LacZ基因上游引物為5'-TGGGAGGCTCAAAGCAAGAC-3'，下游引物為5'-TGACGACAAGGGACAGGTGAT-3'，β-肌動蛋白上游引物為5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'，下游引物為5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'。利用ABI7900HT定量PCR儀，進行實時定量PCR實驗。SDS 2．2軟件對數據進行分析處理，并導出文件及圖像。利用管家基因β-肌動蛋白對目的基因的表達進行校正，得到相對定量結果。

7．β-半乳糖苷酶活性測定:藥物注射48h后每組處死8只大鼠并斷頭取腦，將腦組織液氮保存，蛋白裂解液裂解腦組織并且離心后得到腦組織上清液，BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白量。將提取的組織蛋白上清液與Beta-Glo Assay溶液混合，避光室溫孵育1h，用熒光計中測定混合液的相對光單位(RLU)。繪制標準曲線并將RLU轉換成皮克(pg)，β-半乳糖苷酶的在各個器官中的表達量以皮克/毫克(pg/mg)蛋白的形式表示。

8．統計學方法:應用SPSS 13．0統計軟件包進行統計學分析。各組數據均以均數±標準差±s)的方式表示。采用單向方差分析方法中的Bonferroni法進行各組均數的多重比較。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結果

1．轉鐵蛋白靶向脂質體(Tf-PLs)的特性:合成的脂質體通過光散射的方法測定平均粒徑為100nm，計算得到的脂質體包封率為70．23%～86．24%，平均78．23%。Tf偶聯率平均為69%。脂質體的Zeta電位為30．2mV。

2．組織化學染色:動脈導入組及靜脈導入組可以實現β-半乳糖苷酶在腦內的廣泛性表達，動脈導入組的表達強于靜脈導入組，側腦室及鞘內注射組只能實現腦內的局部表達(圖1)。

圖1 LacZ基因表達產物在大鼠腦內的組織化學染色

3．Real time PCR:藥物注射24h后，動脈導入組LacZ基因mRNA相對量(22．391×10-6)高于靜脈導入組(19．182×10-6，P＜0．05)、側腦室(9．4263× 10-6，P＜0．05)及鞘內注射組(8．732×10-6，P＜0．05)，靜脈導入組與側腦室及鞘內注射組相比具有統計學差異(P＜0．05)。側腦室組與鞘內注射組比較無統計學差異(圖2)。

圖2 LacZ基因在大鼠腦內mRNA的表達

4．β-半乳糖苷酶活性:藥物注射48h后，動脈導入組β-半乳糖苷酶活性為0．91pg/mg，靜脈導入組為0．60pg/mg，側腦室為0．52pg/mg及鞘內注射組為0．49pg/mg。動脈導入組與靜脈導入組、側腦室及鞘內注射組相比，具有顯著性差異(P＜0．05)。靜脈導入組與側腦室組及鞘內注射組相比具有統計學差異(P＜0．05)。側腦室組與鞘內注射組比較無統計學差異(圖3)。

圖3 LacZ基因在大鼠腦內的表達

討論

由于血腦屏障的存在，因此我們將LacZ基因包裹于轉鐵蛋白靶向脂質體內通過股靜脈、頸內動脈、側腦室及鞘內的方式，注射至大鼠體內，觀察LacZ基因在大鼠腦內的表達，從而尋找一種方便、快捷，但又能夠實現腦內高效表達的一種給藥途徑。有文獻報道，在血腦屏障的血管內皮表面可以表達轉鐵蛋白的受體，偶聯有轉鐵蛋白的脂質體可以攜帶外源基因，依靠配體、受體相結合的靶向作用，激發血管內皮的轉運途徑，使脂質體跨越血腦屏障，進入腦內［1，2］。以往研究表明，在轉鐵蛋白靶向脂質體的協助下通過靜脈途徑可以將外源基因轉運至腦內，實現其在腦內的廣泛性表達。在我們的研究中也發現，將LacZ基因包裹至轉鐵蛋白靶向脂質體內，通過靜脈注射的方式可以實現LacZ在腦內的廣泛性表達［3～5］。但是，也有文獻報道，通過側腦室注射的方式，可以更好地實現外源基因在腦內的表達。因此我們在本實驗中將轉鐵蛋白靶向脂質體通過靜脈、動脈、側腦室及鞘內4種方式，注射至大鼠體內，通過組織化學染色、目標基因mRNA檢測以及目標基因蛋白產物的表達，比較4種注射途徑在轉導外源基因應用過程中的優缺點［6，7］。

在組織化學染色中，我們發現動脈導入組可以更好地實現LacZ基因在顱內的廣泛性表達，且表達強度要高于靜脈導入組。靜脈導入組雖然也可以實現顱內的廣泛性表達，但是其表達強度要低于動脈導入組，考慮原因是通過靜脈注射后，脂質體要經過全身的血液循環，從而會導致部分脂質體的損失。雖然我們合成的脂質體能夠在血液中維持一定的穩態，避免吞噬細胞將其作為外來異物清除掉，但是有文獻報道，脂質體仍然會在脾臟、肺臟中進行沉積，從而導致脂質體的損失，影響其攜帶外源基因進入腦內的表達［8～13］。側腦室注射組和鞘內注射組只能實現腦室局部的局限性表達，在遠離腦室的部位很難發現LacZ基因的表達，因此這兩種方法在動物實驗，特別是大鼠缺血性腦卒中的實驗中，由于腦梗死后缺血半暗帶分布的廣泛性，治療基因只是在局部表達，很難實現滿意的治療效果。因此，動脈和靜脈導入方法使外源基因在空間分布上的優越性，使這兩種方式成為比較好的外源基因導入途徑。

在LacZ基因mRNA檢測及表達產物β-半乳糖苷酶活性測定的實驗中，我們同樣發現通過動脈及靜脈途徑導入的方法，與側腦室及鞘內注射的方法比較，可以更高效地表達目的基因。但是，在我們的實驗中，由于我們提取的是大鼠全部腦組織，在此基礎上對LacZ基因的mRNA及β-半乳糖苷酶活性進行測定，因此掩蓋了側腦室及鞘內注射途徑在局部部位的高表達的優勢，即其在數量上的優勢。因此我們認為，根據不同動物模型的需要，如果是治療廣泛性病變，采用動脈途徑或靜脈途徑可以實現較好的空間分布性，如果治療的病變較為局限，可以采納側腦室或鞘內注射的方式。

此外，動脈途徑和靜脈途徑比較，由于動脈途徑需要暴露大鼠的頸總動脈系統，對于實驗動物的創傷較大，而且對實驗人員的顯微解剖和手術技巧要求較高。而靜脈途徑只需要暴露大鼠股靜脈，甚至技術熟練的實驗人員可以通過尾靜脈注射的方式給藥，從而節約大量的時間，提高了實驗效率。側腦室注射需要涉及到立體定向裝置和專門的穿刺針，對于手術技術的要求更高。因此，在滿足實驗要求的前提下，采取靜脈導入外源基因是一種比較便捷、高效的注射途徑。

1Pardridge WM，Boado RJ．Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier［J］．Methods Enzymol，2012，503:269-292

2McCarthy RC，Kosman DJ．Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB［J］．Biometals，2012，25(4):665-675

3Omori N，Maruyama K，Jin G，et al．Targeting of post-ischemic cerebral endothelium in rat by liposomes bearing polyethylene glycolcoupled transferrin［J］．Neurol Res，2003，25(3):275-279

4Zhao H，Bao XJ，Li GL，et al．Postacute ischemia VEGF transfer by transferrin targeted liposomes attenuates ischemic brain injury after experimental stroke in rats［J］．Human Gene Therapy，2011，22(2): 207-215

5Zhao H，Li GL，Wang RZ，et al．A comparative study of transfection efficiency between liposomes，immunoliposomes and brain-specific immunoliposomes［J］．J Int Med Res，2010，3(38):957-966

6唐劭年，劉振華，趙連旭，等．側腦室注射免疫脂質體介導GFP基因腦內表達時程［J］．中風與神經疾病雜志，2006，23(2):220-222

7Nishida F，Morel GR，Here?ú CB，et al．Restorative effect of intracerebroventricular insulin-like growth factor-I gene therapy on motor performance in aging rats［J］．Neuroscience，2011，177:195-206

8Even-Chen S，Cohen R，Barenholz Y．Factors affecting DNA binding and stability of association to cationic liposomes［J］．Chem Phys Lipids，2012，165(4):414-423

9Yemi?ci M，Gürsoy-?zdemir Y，Caban S，et al．Transport of a caspase inhibitor across the blood-brain barrier by chitosan nanoparticles［J］．Methods Enzymol，2012，508:253-269

10Kono K，Torikoshi Y，Mitsutomi M，et al．Novel gene delivery systems:complexes of fusigenic polymer-modified liposomes and lipoplexes［J］．Gene Ther，2001，8(1):5-12

11Zhang X，Servos MR，Liu J．Ultrahigh nanoparticle stability against salt，pH，and solvent with retained surface accessibility via depletion stabilization［J］．J Am Chem Soc，2012，134(24):9910-9913

12Gang W，Jie WJ，Ping ZL，et al．Liposomal quercetin:evaluating drug delivery in vitro and biodistribution in vivo［J］．Expert Opin Drug Deliv，2012，9(6):599-613

13Soni V，Kohli DV，Jain SK．Transferrin-conjugated liposomal system for improved delivery of 5-fluorouracil to brain［J］．J Drug Target，2008，16(1):73-78

(收稿:2012-06-29)

(修回:2012-07-08)

Correlations Between Gene Transfer Approaches and Intracerebral Gene Expression．

Zhao Hao，Li Yunjun，Chen Lihua，Wei Qun，Dai Yiwu，Xu Ruxiang，Wang Renzhi．Bayi Brain Hospital Affilated With The Military General Hospital of Beijing PLA，Beijing 100700，China

ObjectiveTo compare intracerebral expression of transferrin targeted LacZ gene pegylated liposomes(Tf-PLs)transferred by different approaches via the femoral vein，internal carotid artery(ICA)，lateral ventricle(LV)and intrathecal routes in rats，in an attempt to seek a safe and effective approach for gene transfer appropriate for clinical use．MethodsMale SD rats were randomized in to four groups and Tf-LacZ was injected into the rats via the femoral vein，ICA，LV and intrathecal routes，respectively．Eight animals from each group were sacrificed and the brains were removed 24 and 48 h after Tf-LacZ injection．The expression of LacZ encoded βgalactosidase(β-gal)was observed under an optical microscope．LacZ mRNA expressions in different groups at the designated time points were detected by RT-PCR，and the expressions of β-gal were detected by Reagent kit．The results obtained were compared．ResultsExtensive expression of β-gal was achieved in the femoral vein and ICA groups，and the expression of LacZ mRNA in the CA group was significantly high than that in the femoral vein group(P＜0．05)．Only local expression was achieved in the LV and intrathecal groups，and the expressions of LacZ mRNA and β-gal activity in these two groups were significantly lower than those in the femoral vein and ICA groups(P＜0．05)．ConclusionThe effect of transferring exogenous gene into the rat brain was the best in the arterial injection group，and the effect in the venous injection group was better than that in the LV and intrathecal injection groups．The venous transfer route is easier，more convenient and more effective than the other routes in terms of practical feasibility．

Lipiosomes;Transferrin;Blood brain barrier;Transfer approach

國家自然科學基金資助項目(81100917)

100700北京軍區總醫院附屬八一腦科醫院(趙浩、李運軍、陳立華、魏群、戴宜武、徐如祥);100730中國醫學科學院北京協和醫院(王任直)

徐如祥，電子信箱:zjxuruxiang@163．com