哮喘大鼠氣道平滑肌細胞ERK信號通路調控Smad6/7的研究

盧虹蓓 張維溪 李昌崇

哮喘大鼠氣道平滑肌細胞ERK信號通路調控Smad6/7的研究

盧虹蓓 張維溪 李昌崇

目的探討在哮喘大鼠氣道平滑肌細胞(ASMC)中ERK信號通路對Smad6/7蛋白的調控。方法復制哮喘大鼠模型，原代培養ASMC，實驗設未干預組(A組)、細胞外調節激酶(ERK)阻斷劑(U0126)組(B組)、血小板源性生長因子(PDGF)組(C組)、PDGF+ERK阻斷劑組(D組)。免疫組化法測定Smad6/7蛋白的表達，反轉錄－聚合酶鏈反應(RT－PCR)法測定Smad6/7 mRNA表達。結果哮喘大鼠ASMC中Smad 6/7蛋白B組顯著高于A組(P＜0．01)，C組顯著低于A組(P＜0．01)，D組與A組比較無統計學差異(P＞0．05);各組哮喘大鼠ASMC中Smad6/7 mRNA表達無統計學差異。結論哮喘大鼠ASMC中ERK信號通路調控Smad6/7的作用發生在蛋白水平，不發生于基因水平。

哮喘氣道平滑肌細胞細胞外調節激酶Smad

我們通過體外培養哮喘大鼠氣道平滑肌細胞(ASMC)，血小板源性生長因子(PDGF)刺激哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖以及ERK特異性抑制劑U0126阻斷ERK通路后，觀察Smad6/7蛋白及其mRNA在哮喘大鼠氣道平滑肌細胞內表達情況，探討ERK信號通路對Smad6/7的影響。

材料與方法

1．主要試劑:DMEM培養基(法國Biowest公司)，胎牛血清(法國Biowest公司)，胰蛋白酶(法國Biowest公司)，大鼠IL－lβ雙抗夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(美國Biosouree公司)，大鼠抗小鼠α－actin單克隆抗體(武漢博士德公司)，兔抗大鼠Smad 6/7多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，重組大鼠PDGF－BB(美國R＆D公司)，U0126(美國Cell Singnal Technology公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，RT－PCR試劑盒(美國Fermentas公司)，Smad6/7和GAPDH引物(上海生工合成)序列如下:Smad6上游引物:5'－TGACTGCGAGACGGTGACTT－3'，Smad6下游引物:5'GGGACTCTACAGCCTCCAACAG－3'，產物242 bp;Smad7上游引物:5'－GACAAGGGAAGTGGATGGC－3'，Smad7下游引物:5'－TTAGCAGCAAGTAGTTTGAACG－3'，產物389bp;GAPDH上游引物:5'－CAAGTTCAACGGCACAGTCAA－3'，GAPDH下游引物:5'－TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC－3'，產物140bp。

2．實驗動物:SPF級健康雄性SD(Sprague－Dawlay)大鼠24只，4～6周，體重120～160g。溫州醫學院動物實驗中心提供。

3．哮喘動物模型的建立:復制我們既往已建立的哮喘大鼠模型，按隨機數字表法取12只大鼠，第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1．5ml［內含OVA1mg和Al(OH)3100mg］［4，5］。激發階段，第15天開始以1%OVA生理鹽水溶液霧化吸入，隔天1次，每次30min，共60天，為哮喘大鼠，以備下一步哮喘大鼠ASMC培養所用。按隨機數字表法另外12只為對照組，參照哮喘組方法，但致敏和激發時均以生理鹽水代替OVA。各組均于末次激發后2h處死，留取血清并立即開胸，右肺經支氣管肺泡灌洗留取BALF，切下左肺組織用于病理切片、免疫組織化學檢測。

4．光鏡及電鏡觀察:光鏡下觀察HE染色的肺組織中的支氣管周圍炎癥細胞浸潤和平滑肌增殖情況。每組各取1只大鼠，用H－600型透射電鏡觀察肺組織超微結構變化。

5．BALF中細胞分類計數:瑞氏－姬姆薩染色行白細胞分類計數。

6．支氣管壁厚度(Wat)和氣道平滑肌厚度(Wam)檢測:挑選每只大鼠3～5支有完整橫斷面的中小支氣管，應用Medlab生物信號采集系統(南京瑯珈公司)采集圖像，醫學圖像分析軟件Image．pro plus 5.0測量肺內支氣管基膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(Wat1)、管腔面積(Wat2)，平滑肌外緣內氣管面積(Wam1)，平滑肌內緣內氣管面積(Wam2)，并用Pbm標準化，即分別以(Wat1－Wat2)/Pbm和(Wam1－Wam2)/Pbm來表示Wat和Wam。

7．ELISA法檢測血清、BALF IL－1β含量:應用ELISA法測定血清和BALF中IL－1β濃度，測定方法按試劑說明書進行。

8．哮喘大鼠ASMC的培養和鑒定:取哮喘組已建立哮喘模型大鼠，以膠原酶－胰酶混合消化法培養哮喘大鼠ASMC，細胞生長融合后，用0．25%的胰蛋白酶消化，以107～108/L的密度傳代培養，對細胞進行形態學觀察并對細胞內平滑肌肌動蛋白α－actin進行免疫細胞化學染色，95%以上的細胞呈陽性著色，證實細胞為ASMC［8］。取生長狀態良好的3～5代細胞用于實驗。

9．哮喘大鼠ASMC的分組:取哮喘組已建立哮喘模型大鼠ASMC按加入藥物及濃度的不同分為未干預組(A組)，加無血清DMEM 2ml;ERK阻斷劑組(B組)，加含U0126的濃度10μmol/L的DMEM 2ml;PDGF組(C組)，加含PDGFBB濃度50μg/L的DMEM2ml;PDGF+ERK阻斷劑組(D組)，加含PDGF－BB和U0126的濃度分別為50μg/L和10μmol/L的DMEM2ml。

10．哮喘大鼠ASMC的藥物干預:細胞按6×103/cm2的密度接種于6孔板，待細胞長至接近融合時，吸出培養液，DHanks液洗細胞，加入含l%胎牛血清的DMEM/F12培養液，細胞饑餓24h，使細胞同步化于G0期，加入不同濃度的PDGF－BB和U0126，作用一定時間后，無血清培養基洗細胞，等待下一步實驗。

11．免疫組化SP法檢測細胞Smad6/7蛋白表達:哮喘大鼠ASMC內Smad 6/7蛋白的表達:從6孔板內取出爬有細胞的蓋玻片，用SP法對細胞進行染色，胞質內棕黃色沉淀為陽性結果，應用image－pro plus圖像分析軟件測定陽性部位的平均吸光度(mean optical density，MOD)，用以代表陽性部位的蛋白表達水平。

12．RT－PCR法測ASMC內Smad6/7 mRNA的表達:提取哮喘大鼠ASMC總RNA，取1μl RNA樣品加99μl DEPC處理的水中，混勻，采用紫外分光光度法測定OD260、OD280的值。RNA純度以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1．8～2.0之間。反轉錄反應體系體積為30μl，GAPDH和Smad同管擴增，每管加總RNA約1μg。RT－PCR反應條件為:42℃反轉錄60min，94℃預變性5min，然后92℃30s，58/60℃30s，72℃30s反應37個循環，72℃充分延伸8min，4℃終止反應。產物用2%瓊脂糖電泳，用SmartView凝膠數字成像系統掃描分析擴增產物條帶，Smad6/7 mRNA的相對含量用Smad6/7與GAPDH吸光度的比值表示。

13．統計學方法:用SPSS 10．0軟件對數據進行分析:數據均以均數±標準差±s)表示，兩組樣本均數比較采用t檢驗;多組樣本均數比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結果

1．一般情況:哮喘組在激發時均出現不同程度的煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁等癥狀，嚴重者呼吸減慢或節律不齊，行動遲緩或俯伏不動，而對照組無上述表現。經過多次激發后，哮喘組上述癥狀反而有所減輕，但體重增長減慢，毛色無光澤。

2．病理改變:光鏡下觀察HE染色的哮喘大鼠肺組織中的支氣管周圍炎癥細胞浸潤和平滑肌增殖情況(圖1～圖3)。

3．BALF中白細胞分類計數:哮喘組嗜酸粒細胞百分比［(9．10±2．27)%］高于對照組［(0.91± 0.87)%，t=2.27，P＜0.01］。

4．哮喘大鼠與對照組平滑肌細胞厚度比較(μm2/μm±s):哮喘大鼠Wat檢測結果(73．4± 5.6)高于對照組(35．7±1．7)(P＜0.01);哮喘大鼠Wam檢測結果(38．9±4．2)高于對照組(14．5±1．1) (P＜0.01)。

6．ASMC內Smad6/7蛋白表達:哮喘大鼠ASMC中Smad 6/7蛋白B組顯著高于A組(P＜0．01)，C組Smad 6/7蛋白顯著低于A組(P＜0．01)，D組與A組比較無統計學差異(P＞0．05)(圖4～圖5、表1)。

7．ASMC內Smad6/7 mRNA的表達:各組哮喘大鼠ASMC內Smad6/7的表達無顯著性差異(P＞0.05)(圖6～圖7、表2)。

表1 免疫組化檢測各組哮喘大鼠氣道平滑肌細胞Smad6/7蛋白表達(MOD±s)

表1 免疫組化檢測各組哮喘大鼠氣道平滑肌細胞Smad6/7蛋白表達(MOD±s)

與A組比較，★P＜0．01，△P＞0．05

組別重復次數平均吸光度(MOD) Smad6Smad7 A組100．41±0．020．56±0．05 B組100．69±0．05★0．78±0．03★C組100．23±0．04★0．34±0．05★D組100．43±0．03△0．53±0．02△F＜0．01＜0．01 206．3114．7 P

表2 各組ASMC Smad6/7 mRNA的表達

討論

ERK信號轉導通路廣泛存在于多種細胞內，是MAPK信號通路的3個家族成員之一，已發現它在氣道平滑肌上廣泛分布，主要以ERK1、ERK2兩種亞型存在［9］。ERK主要介導生長因子如:血小板源性生長因子(platelet－derived growth factor，PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastgrowth factor，bFGF)、胰島素樣生長因子(insulin－like growth factors，IGFs)等的細胞內信號轉導，調節細胞的增殖、分化、遷移等生物學行為。I－Smad(Smad6和Smad7)蛋白是轉化生長因子－β(TGF－β)細胞內信號轉導的負調控蛋白，其功能是抑制受體激動的Smads蛋白介導的信號轉導，阻斷TGF－β介導的轉錄反應。研究發現Smad7較Smad6的抑制作用更為顯著，Smad7由TGF－β誘導產生，是TGF－β信號轉導途徑的主要抑制性調控蛋白。Nakao等［10］免疫組化法觀察發現哮喘組和正常組Smad7蛋白均主要表達于支氣管上皮細胞，哮喘組較正常組低表達，Western blotting法檢測亦顯示正常組Smad7抗體較哮喘組高表達。哮喘患者支氣管上皮細胞Smad7表達水平與基膜厚度及AHR呈負相關，Smad7抑制氣道重塑部分通過抑制TGF－β介導的轉錄反應，支氣管上皮細胞Smad7的表達調控與哮喘氣道重塑和AHR密切相關。抑制TGF－β和BMP的信號轉導的Smad6也是TGF超家族中骨形態發生蛋白信號的抑制因子，是TGF信號和BMP信號的負性調節交叉點，Smad6由BMPs誘導產生，其編碼基因位于15q21～22染色體上。研究發現TGF－β超家族成員可以有效地誘導Smad6的mRNA的產生，Smad6可以通過自分泌負反饋環來控制TGF－β信號的強度和持續時間［11］。但其調節機制與Smad7不同，它不是作用于受體蛋白激酶，而是與Smad4競爭并結合被受體激活的R－Smad(如Smad1)，形成無活性的Smad聚合體，起到干擾該信號系統的轉導的效目前Smad6作為I－Smad在哮喘氣道重塑中的報道在國內外尚少。

本實驗在哮喘大鼠ASMC中，用PDGF刺激致ASMC增殖，免疫組化法測得Smad6和Smad7蛋白表達減少;U0126阻斷PDGF對ERK蛋白活化作用后，Smad6和Smad7蛋白表達卻增加。本實驗結果和上述研究結果以及本課題前期在動物模型中研究結果得出的結論基本一致:Smad6和Smad7蛋白是TGF－β細胞內信號轉導的負調控蛋白，另外ERK通路可能對Smad通路在胞質內(蛋白水平)發生調節。

由于各實驗的研究目的不同，研究對象、細胞類型以及所用的刺激因子也各不相同，因而對于ERK通路與TGF/Smad通路在細胞核內(基因水平)是否存在交聯，目前尚無定論。在人腎小球系膜細胞中Ox－LDL能通過TGF－β/Smad信號通路促進纖溶酶原活化因子抑制劑－1(PAI－1)表達，TGF－β/ Smad信號通路激活ERK信號通路，ERK信號通路則與Smad2/3的激活有關。用ERK抑制劑PD98059或UO126處理后，則顯著抑制了Ox－LDL介導的PAI－1 mRNA增加和Smad3的核表達以及蛋白復合物的形成，說明ERK活化后參與了Ox－LDL介導的Smad3核內激活。而Guo等［12］發現，在腎小球系膜細胞內，TGF－β促使Smad蛋白核轉導以及Smad與SBE結合的效應不受ERK的調節。在成骨系MC3T3－E1細胞內，Ras－ERK通路不影響由TGF受體激活的Smad3的轉錄活性，提示ERK通路與TGF/ Smad通路在細胞核內也許不發生交互調節作用。Hong等研究了在人腎小球系膜細胞中氧化修飾低密度脂蛋白(Ox－LDL)介導的TGF－β信號通路和ERK激活的PAI－1轉錄呈正相關。本課題探討哮喘大鼠ASMC中ERK信號通路對Smad6/7基因表達是否起調控作用。我們用RT－PCR技術檢測了哮喘大鼠ASMC內Smad6/7 mRNA的表達，結果發現用PDGF激活ERK通路或用U0126阻斷ERK通路后對Smad6/7 mRNA的表達沒有影響。

總之，本研究發現在哮喘大鼠ASMC中ERK信號通路調控Smad6/7的作用發生在蛋白水平，不發生于基因水平。

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5李昌崇，管小俊，張維溪，等．細胞外信號調節激酶信號轉導途徑在哮喘大鼠氣道重塑中作用及糖皮質激素的調控［J］．中華兒科雜志，2007，45(4):288－292

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8盧虹蓓，張維溪，李昌崇．哮喘大鼠氣道平滑肌細胞培養方法探討［J］．溫州醫學院學報，2009，39(3):264－266

9Masuda T，Tanaka H，Komai M，et al．Mast cells play a partial role in allergen－induced subepithelial fibrosis in a murine model of allergic asthma［J］．Clin Exp Allergy，2003，33(5):705－713

10Nakao A，Sagara H，Setoguchi Y，et al．Expression of Smad7 in bronchial epithelial cells is inversely correlated to basement membrane thickness and airway hyperresponsiveness in patients with asthma［J］．J Allergy Clin Immunol，2002，110(6):873－878

11Whitman M．Signal transduction．feedback from inhibitory SMADs［J］．Nature，1997(389):549－551

12Guo B，Inoki K，Isono M，et al．MAPK/AP－1－dependent regulation of PAI－1 gene expression by TGF－beta in rat mesangial cells［J］．Kidney Int，2005，68(3):972－984

(收稿:2011－07－16)

(修回:2011－08－23)

Regulation of ERK Signal Pathway on Smad6/7 in Ariway Smooth Muscle Cells of Asthmatic Rats．

Lu Hongbei，Zhang Weixi，Li Changchong．Department of Respiratory Diseases，Affiliated Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang 325027，China

ObjectiveTo explore the effect of ERK signal pathway on Smad 6/7 in ariway smooth muscle cells(ASMC)of asthmatic rats．MethodsAsthmatic rats were copied．ASMC were cultured from asthmatic rats which were divided into four groups:control group (group A)，external signal regulated kinase(ERK)blocking agent(U0126)group(group B)，platelet－derived growth factor(PDGF) group(group C)，PDGF plus ERK blocking agent group(group D)．The protein expressions of Smad6/7 were detected by immunohistochemistry technique，and the mRNA expressions of Smad6/7 were detected by RT－PCR．ResultsThe expression of Smad6/7 protein in ASMC of group B was significantly higher than group A(P＜0．01)，and group C were significantly lower than group A(P＜0．01)．There were no significant difference between group D and group A(P＞0．05)．There were no difference in the mRNA expressions of Smad6/7 among all these groups(P＞0．05)．ConclusionThe regulatory role of ERK signal pathway on Smad6/7 in ASMC of asthmatic rats was on the level of protein，but not on the level of gene．

Asthma;Airway smoth muscle cells;External signal regulated kinase;Smad

氣道重塑是支氣管哮喘(簡稱哮喘)的特征性病理生理改變之一，是哮喘潛在的治療靶點［1］。氣道平滑肌細胞(ASMC)增殖在氣道重塑中占有十分重要的地位，有報道顯示哮喘病人氣道平滑肌厚度是對照組的3倍［2］。當前，體外氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMC)培養是研究哮喘發病機制的重要手段。ERK信號轉導通路廣泛存在于多種細胞內，是MAPK信號通路的3個家族成員之一，已發現其在氣道平滑肌上廣泛分布，主要以ERK1、ERK2兩種亞型存在［3］。我們既往的研究表明，ERK介導的信號轉導途徑在ASMC增殖中發揮著十分重要的作用［4，5］。Smads蛋白是TGF－β信號轉導系統的重要成員，是TGF－β受體復合物的下游信號調節蛋白，參與調控細胞的增殖、轉化、合成、分泌和凋亡［6］。TGF－β1被認為是哮喘氣道重塑的主要調控因子，直接影響氣道壁膠原沉積，促進纖維化的形成［7］。已知ERK通路和TGF－β/Smad通路在許多細胞中可發生對話，共同協調細胞的一些生物學行為，并且這兩條通路都可促進ASMC的增殖，但這兩條通路在哮喘發病中是否存在交互調節及它們之間發生交互調節的具體環節及分子機制目前還不清楚。

國家自然科學基金資助項目(30571981、30271383)

325027溫州醫學院附屬育英兒童醫院呼吸科(盧虹蓓、張維溪、李昌崇);麗水市中心醫院兒科(盧虹蓓)

李昌崇，電子信箱:wzlichch@21cn．com