蛋白酶抑制劑leupeptin增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用

王瑩 吳淑英 甄永蘇

蛋白酶抑制劑leupeptin增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用

王瑩 吳淑英 甄永蘇

目的研究蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)leupeptin對化療藥物紫杉醇(taxol，TAX)、吉西他濱(gemcitabine，GEM)以及平陽霉素(pingyangmycin，PYM)在體外抑制腫瘤細胞增殖作用的影響。方法選取一定濃度梯度的酶抑制劑leupeptin單獨或聯合TAX、GEM和PYM與腫瘤細胞孵育，48h后采用MTT法測定腫瘤細胞生長的變化并與相應濃度的TAX、GEM和PYM單藥組相比較。采用流式細胞術測定MCF－7細胞周期分布。結果leupeptin在濃度高于50μmol/L時可增強化療藥物對肺癌PG細胞和乳腺癌MCF－7細胞增殖的抑制作用。leupeptin對TAX的增效作用尤為顯著。leupeptin與低濃度的GEM和TAX聯合應用可改變MCF－7的細胞周期分布。結論leupeptin可增強化療藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用，但其作用程度與腫瘤細胞株的種類、化療藥物的種類及leupeptin的濃度均相關。

LeupeptinMCF－7細胞PG細胞增殖抑制

化療增敏劑是指在所用濃度或劑量下沒有抗腫瘤作用或抗腫瘤作用很小，但能影響已知有抗腫瘤作用藥物的細胞毒作用，從而可增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷作用或降低其對正常組織細胞毒性的一類藥物。目前對腫瘤化療增敏劑的研究較多。主要側重于多藥耐藥蛋白、藥物代謝酶及DNA的修復等相關方面。另一些研究集中于改變腫瘤細胞的外周環境，以期待改良腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。目前的一些研究探討微環境與腫瘤細胞之間相互關系，進而影響腫瘤細胞對于抗腫瘤藥物的敏感性。此外還有一些學者研究基質金屬蛋白酶抑制劑對血管生成的抑制，影響腫瘤細胞侵襲、轉移和生長等。這些低分子化合物化學結構多樣，作用于腫瘤細胞的多種靶點，對化療藥物的藥效均起到了一定的促進作用。

leupeptin是一種廣泛的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制物，能抑制其他細胞中的程序化細胞死亡，被認為是參與凋亡進程的蛋白酶抑制劑，呈底物競爭抑制作用［1，2］。最初由X射線在小鼠C3H10T 1/2細胞的致癌性轉化誘導的實驗中，作為絲氨酸和巰基蛋白酶(如胰蛋白酶、血纖維蛋白溶解酶、木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B)的抑制劑。隨后被證實可減弱化學致癌劑對大鼠的作用［3］。其分子結構為Acetyl－ Leu－Leu－Arginal，是一種低分子肽醛類化合物。多種細胞外周(包括細胞表面和釋放于外周)的組織蛋白酶活性均可為leupeptin所抑制［4］。它作為一種工具藥物被廣泛的應用于生化實驗中。多種研究表明leupeptin作用于腫瘤細胞的多種信號通路和多個靶點，主要作用于細胞遷移方面，對細胞內的多種酶類也有一定的影響。對于leupeptin的研究，涉及多種組織和細胞［5，6］。本實驗擬研究leupeptin與化療藥物聯合對腫瘤細胞增殖的影響。實驗選取3種不同機制的抗腫瘤藥物:抗代謝類藥物吉西他濱(gemcitabine，GEM)、抗微管解聚類藥物紫杉醇(taxol，TAX)和DNA干擾藥物平陽霉素(pingyangmycin，PYM)，研究酶抑制劑leupeptin與化療藥物聯合應用對腫瘤細胞增殖作用的影響。

材料與方法

1．材料:①細胞株:人高轉移巨細胞肺癌PG細胞株和人乳腺腺癌MCF－7細胞株由本室傳代保存;②leupeptin:美國Ameresco公司產品;③注射用鹽酸吉西他濱:江蘇森豪藥業有限公司產品;④紫杉醇注射液:北京協和藥廠產品;⑤注射用鹽酸平陽霉素:天津太河制藥有限公司產品。⑥MTT:購自北京經科宏達公司。⑦RPMI 1640培養基:Hyclone公司提供，標準胎牛血清:Gibco公司提供。

2．MTT法檢測細胞的增殖作用:①細胞培養:PG細胞和MCF－7細胞用含10%胎牛血清的培養基RPMI 1640培養液在37℃，5%CO2條件下培養;②采用四氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度的leupeptin與GEM、TAX和PYM單獨及聯合對PG與MCF－7細胞生長的影響。將細胞懸液以5000個/孔接種與96孔板中，培養48h后分別加leupeptin，3h后加入GEM、TAX和PYM。同時設置空白組、對照組和聯合組。48h后以MTT法檢測細胞毒作用，計算細胞存活率T/C(%)及兩藥相互作用指數(coefficient of drug interaction，CDI)。計算方法如下:細胞存活率T/C(%)=加藥組細胞的吸光值/對照組細胞的吸光值×100%;CDI=AB/(A×B)。AB為兩藥聯合作用組的T/C值，A、B是藥物單獨作用組的T/C比值。當CDI＜1時兩藥有協同作用。

3．PI單染流式細胞術檢測細胞周期分布:離心收集藥物處理過的細胞，用冰冷的PBS緩沖液沖洗后，離心倒掉上清保留少許液體，加－20℃預冷的乙醇至70%濃度，固定過夜，磷酸緩沖液洗3次后，經RNase消化30min，碘化丙錠(propidium iodide，PI)37℃染色30min以上，300目尼龍網過濾后，COULTER EPICS XL流式細胞分析儀測定細胞周期分布。

結果

1．leupeptin與GEM聯合對腫瘤細胞增殖的影響:用MTT法檢測不同濃度的leupeptin和GEM處理PG細胞和MCF－7細胞后，leupeptin與GEM的聯合組對PG細胞和MCF－7細胞的生長的抑制作用較對照組(P＜0．05)略有增加。各實驗組的細胞存活率見圖1中A1和A2。同等劑量下，GEM對PG細胞的增殖抑制作用強于與MCF－7細胞。PG細胞和MCF－7細胞對leupeptin的敏感度不同。leupeptin可在一定水平增強GEM對MCF－7細胞的增殖抑制作用，但是對PG細胞的作用卻較弱。在MCF－7細胞組中50μmol/L以上的leupeptin對各濃度組的細胞增殖抑制均有加強作用，100μmol/L leupeptin與5μmol/L的GEM的聯合組與5μmol/L GEM單獨組，細胞存活率分別為94．05%±1．92%和76．92%± 2.64%，100μmol/L leupeptin單獨組為92．00%± 9.96%，兩藥的CDI值為0．892(CDI＜1)。而在PG細胞組中僅在高濃度的GEM組出現明顯的增殖抑制加強，100μmol/L leupeptin與20μmol/L的GEM的聯合組與20μmol/L GEM單獨組，細胞存活率分別為56．08%±4．84%和66．21%±1．55%，100μmol/L leupeptin單獨組為93．05%±3．32%，兩藥的CDI值為0．872(CDI＜1)。

2．leupeptin與TAX聯合對腫瘤細胞增殖的影

圖1 不同濃度leupeptin與GEM、TAX和PYM聯合應用對MCF－7和PG細胞增殖的影響

3．leupeptin與PYM聯合對腫瘤細胞增殖的影響:用MTT法檢測不同濃度的leupeptin和PYM處理PG細胞和MCF－7細胞后，leupeptin與PYM的聯合組對PG細胞和MCF－7細胞的生長的抑制作用較對照組(P＜0．05)顯著增加。其細胞增殖的抑制率見圖1中C1和C2。PYM的實驗結果與GEM類似，leupeptin對MCF－7細胞抑制的增效作用較PG細胞為強。在MCF－7細胞組實驗中100μmol/L leupeptin與20μmol/L的PYM的聯合組與20μmol/L PYM單獨組，細胞存活率分別為68．06%±1．14%和56.85%±7.14%，100μmol/L leupeptin單獨組為92．00%±9．96%，兩藥的CDI值為0．926(CDI＜1)。在PG組細胞實驗中100μmol/L leupeptin與1μmol/L的PYM的聯合組與1μmol/L PYM單獨組，細胞存活率分別為78．66%±1．39%和96．27%± 5.79%，100μmol/L leupeptin單獨組為93．05%± 3.32%，兩藥的CDI值為0．878(CDI＜1)。

4．藥物對細胞周期分布的影響:為進一步研究兩藥聯合對腫瘤細胞增殖抑制的機制，采用流式細胞術檢測藥物對細胞周期分布的影響。藥物分別作用于MCF－7細胞，48h收集細胞，PI染色后，流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗結果如圖2和表1所示。與對照組相比，單獨應用100μmol/L leupeptin對細胞周期無影響。leupeptin的加入可影響GEM和TAX對MCF－7細胞的細胞周期阻滯作用。100μmol/L leupeptin與2μmol/L GEM聯合組可以使G1期的細胞比例增加，100μmol/L leupeptin與0.5μmol/L TAX聯合組使S期細胞增加。

圖2 leupeptin與GEM和TAX對MCF－7細胞周期時相分布的影響

表1 GEM、TAX和leupeptin聯合應用對MCF－7細胞周期分布的影響

討論

leupeptin廣泛的應用于抑制多種的絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶類。它的作用特點是作用范圍廣，但是特異性不強，可作用于細胞生長及腫瘤形成的多個階段。據報道leupeptin在體外可抑制胰腺癌細胞跨越基質膠屏障發生遷移［7］。其原因在于抑制了可降解腫瘤細胞外基質的蛋白酶類，這些酶類可參與腫瘤細胞的遷移。leupeptin可明顯降低黑色素瘤細胞的遷移，該結果提示半胱氨酸水解酶在腫瘤遷移過程中具有重要作用［8］。組織蛋白酶B涉及多種腫瘤的的侵襲和轉移，特別是細胞表面和分泌型的cathepsin B。而對cathepsin B和calpain相關的研究發現，leupeptin可以抑制該類cathepsin B［9］。通過比較了博來霉素人頭頸部癌細胞的敏感細胞株和耐藥細胞株后發現，leupeptin可提高耐藥細胞株對博來霉素的敏感性，并表明細胞內的代謝酶參與了該細胞株的耐藥過程［10］。

本研究結果表明leupeptin在體外可部分的提高TAX、GEM和PYM對腫瘤細胞增殖的抑制作用，但其本身并無明顯的細胞毒活性，對細胞周期的分布也不會造成干擾。比較leupeptin在與上述3個化療藥物聯合作用時的CDI值，在一定的濃度聯合均有協同增殖抑制作用(CDI＜1)，100μmol/L leupeptin與20μmol/L TAX和200μmol/L leupeptin與5μmol/L TAX能夠顯著抑制細胞增殖，其CDI＜0．70，具有顯著協同抗腫瘤作用。此外，TAX對腫瘤細胞增殖抑制作用的影響還具有如下的幾個特點:①具有藥物的選擇性:對細胞毒性較強的藥物如紫杉醇的作用效果較其他兩種藥物為顯著，對多個藥物劑量組均呈增強作用。而吉西他濱對腫瘤細胞的增殖抑制作用相對較弱，僅在高濃度的吉西他濱與leupeptin聯合組出現了增強作用;②腫瘤細胞株對leupeptin的敏感性有差異。從本實驗可以看出，MCF－7細胞對leupeptin的敏感度要高于PG細胞，在多種藥物的多個濃度水平均有提高作用;③leupeptin需要在濃度較高時起效，呈現劑量依賴趨勢。上述的幾組實驗數據顯示，leupeptin至少要在濃度高于50μmol/L時才會起到增效作用。結合以上3個特點，可以看出leupeptin的作為增效劑的活性有特殊性。

在本研究中，MCF－7細胞對leupeptin的敏感性要高于PG細胞，尤其是與紫杉醇聯合的藥物組。相關的研究也探討了各種化合物與化療藥物聯合作用于乳腺癌細胞株，期望能改善化療藥物對乳腺癌，特別是HER－2高表達及多藥耐藥的細胞株的作用。包括天然提取物姜黃素、大黃酸和磷酸二酯酶抑制西地那非等多種低分子成為研究對象。據報道，在HER－2高表達的BT－474細胞株移植模型中發現姜黃素與紫杉醇的聯合用藥組的療效與紫杉醇和herceptin的聯合用藥組相當［11］。賴氨大黃酸能有效抑制SK－Br－3細胞增殖并且能夠通過HER－2信號通路誘導細胞凋亡，還參與了NF－κB/p53/p21等誘導凋亡的多種信號通路，有望成為臨床腫瘤輔助化療藥物［12］。然而，對西地那非進行的相關實驗則沒有取得顯著的效果［13］。綜合上述的實驗結果，leupeptin在體外對腫瘤細胞有明確的抑制作用。鑒于leupeptin廣泛的作用位點，特殊的結構類型，希望通過進一步的研究，將leupeptin及其類似物應用于促進化療藥物的活性、調節細胞信號轉導及誘導細胞分化逆轉多藥耐藥等多種環節發揮抗腫瘤作用。

1Hausott B，Rietzler A，Vallant N，et al．Inhibition of fibroblast growth factor receptor 1 endocytosis promotes axonal branching of adult sensory neurons［J］．Neuroscience，2011，188(11):13－22

2Yang DS，Kumar A，Stavrides P，et al．Neuronal apoptosis and autophagy cross talk in aging PS/APP mice，a model of Alzheimer's disease［J］．Am J Pathol，2008，173(3):665－681

3Kennedy AR，Little JB．Effects of protease inhibitors on radiation transformation in vitro［J］．Cancer Res，1981，41(6):2103－2108

4Huang M，Huang F，Ma HJ，et al．Preliminary study on the effect of caspase－6 and calpain inhibitors on postmortem proteolysis of myofibrillar proteins in chicken breast muscle［J］．Meat sci，2012，90 (3):536－542

5Simmons G，Bertram S，Glowacka I，et al．Different host cell proteases activate the SARS－coronavirus spike－protein for cell－cell and virus－cell fusion［J］．Virology，2011，413(2):265－274

6Watterson TL，Hamilton B，Martin RS，et al．Urban particulate matter activates Akt in human lung cells［J］．Arch Toxicol，2012，86 (1):121－135

7Mamoune A，Luo JH，Lauffenburger DA，et al．Calpain－2 as a target for limiting prostate cancer invasion［J］．Cancer Res，2003，63 (15):4632－4640

8Dennhiffer R，Kurschat P，Zigrino P，et al．Invasion of melanoma cells into dermal connective tissue in vitro:evidence for an important role of cysteine proteases［J］．Int J Cancer，2003，106(3):316－323

9Maes K，Testelmans D，Powers S，et al．Leupeptin inhibits ventilatorinduced diaphragm dysfunction in rats［J］．Am J Respir Crit Care Med，2007，175(11):1134－1138

10Morris G，Mistry JS，Jani JP，et al．Cysteine proteinase inhibitors and bleomycin－sensitive and－resistant cells［J］．Biochem Pharmacol，1991，41(11):1559－1566

11Lai HW，Chien SY，Kuo SJ，et al．The potential utility of curcumin in the treatment of HER－2－overexpressed breast cancer:an in vitro and in vivo comparison study with herceptin［J］．Evid Based Complement Alternat Med，2012:486－568

12林雅軍，黃云虹，甄永占，等．賴氨大黃酸通過抑制HER－2信號通路誘導乳腺癌SK－Br－3細胞凋亡［J］．藥學學報，2008，43 (11):1099－1105

13Di X，Gennings C，Bear HD，et al．Influence of the phosphodiesterase－5 inhibitor，sildenafil，on sensitivity to chemotherapy in breast tumor cells［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，124(2):349－360

(收稿:2012－01－16)

(修回:2012－03－07)

Protease Inhibitor Leupeptin Enhances the Inhibitory Effect of Anticancer Drugs on the Proliferations of Cancer Cells．

Wang Ying，Wu Shuying，Zhen Yongsu．Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Science＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

ObjectiveTo observe the modulating effect of leupeptin，a protease inhibitor，on the anti－proliferation efficacy of anticancer drugs including taxol(TAX)，gemcitabine(GEM)，and pingyangmycin(PYM)in cancer cells．MethodsMammary carcinoma MCF－7 cells and pulmonary carcinoma PG cells were exposed to various concentrations of leupeptin alone or in combination with taxol (TAX)，gemcitabine(EM)，and pingyangmycin(PYM)，respectively．After 48 hours exposure，cell proliferation was determined by MTT assay．Flow cytometry was used to analyze cell cycle distribution．ResultsAt the concentration of 50μmol/L or higher，leupeptin enhanced the inhibitory effect of those three anticancer drugs on the proliferation of both cell line．More marked enhancement was found in the combination of leupeptin and TAX．MCF－7 cell cycle distributions were changed at the low dosage GEM or TAX combination with leupeptin．ConclusionLeupeptin could enhance the inhibition effect of anticancer drugs，in particular，taxol，on cancer cells．The efficacy may be varied in different cell lines and drugs．

Leupeptin;MCF－7 cell;PG cell;Proliferation inhibitor

100050中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所

甄永蘇，電子信箱:zhenys@cae．cn