成骨細胞在精－丙－天－丙16自組裝多肽水凝膠表面培養的研究

張鋒 任靈飛 應永芳 施更生

成骨細胞在精－丙－天－丙16自組裝多肽水凝膠表面培養的研究

張鋒 任靈飛 應永芳 施更生

目的研究小鼠成骨前體細胞MC3T3－E1在自組裝多肽水凝膠材料上黏附、伸展、增殖和分化的能力。方法人工合成短肽精－丙－天－丙16(RADA16)，制備RADA16水凝膠并用掃描電鏡觀察其微觀結構。同時在RADA16多肽水凝膠支架材料上接種MC3T3－E1細胞，觀察細胞黏附、伸展、增殖和分化的情況。結果MC3T3－E1細胞能夠在多肽水凝膠上黏附、伸展和增殖。成骨誘導培養后的細胞有較高水平的ALP、OC表達及礦化基質沉積，成骨相關基因Runx2，OSX，AKP－2和OC也有高表達，且表達量隨著時間的延長而不斷升高。結論自組裝多肽水凝膠能夠支持MC3T3－E1細胞的黏附、伸展、增殖和分化，顯示了良好的生物相容性，可能在牙周炎所致的骨質缺損修復中有廣泛應用。

多肽水凝膠RADA16成骨細胞

本文將研究自組裝多肽水凝膠材料RADA16的微觀結構及其生物相容性，檢測小鼠成骨前體細胞MC3T3－E1在水凝膠支架材料上的黏附、增殖與分化的能力，為下一步的動物實驗提供理論依據。

材料與方法

1．材料及試劑:多肽RADA16由上海波泰公司合成(純度≥95%);DNA含量測定試劑盒(Invitrogen公司，美國);堿性磷酸酶活性測定試劑盒(Wako公司，日本);骨鈣素含量測定試劑盒(Biomedical Technologies公司，美國);實時定量RTPCR試劑盒、引物(TaKaRa公司，日本)。

2．方法:(1)多肽水凝膠的制備:將定制購買的多肽粉末(RADA16)溶于去離子水中配成1%的溶液，接著超聲振蕩30s，然后將50μl的多肽溶液置于載玻片上和96孔細胞培養板中(分別用于檢測水凝膠表征和細胞培養)，以及將200μl的多肽溶液置于24孔細胞培養板中。再接著加入適量的α－MEM培養基來誘導水凝膠的形成。數分鐘后，載玻片上及細胞培養板底部有水凝膠形成。(2)細胞培養:MC3T3－E1細胞置于基本培養液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度的培養箱中常規培養。每2～3天換液1次，待細胞融合至70%～80%時，用含EDTA的0．25%胰蛋白酶消化傳代。將1×104個細胞接種到組裝有多肽水凝膠的載玻片和96孔細胞培養板，同時將5×104個細胞接種到組裝有多肽水凝膠的24孔細胞培養板。分別培養1、3、24h、3、4、7、14和28天，每3天更換完全培養基1次。為了檢測細胞的分化能力，將培養基更換為成骨培養基(添加10mmol/L的β－甘油磷酸和50mg/L的維生素C)。(3)掃描電鏡樣品的制備及觀察:多肽水凝膠材料(其中一半有細胞培養在表面)用2%的戊二醛溶液在4℃條件下固定2h，去離子水沖洗數遍，梯度乙醇溶液脫水各5min，真空冷凍干燥后噴金，掃描電鏡觀察水凝膠的表面結構。(4)細胞形態觀察:將分別培養了1、3、24h及3天的水凝膠支架材料取出，37℃的PBS溶液輕輕漂洗以去除未牢固黏附的細胞，4%多聚甲醛溶液在4℃固定30min，0．1%曲拉通滲透3min，牛血清白蛋白封閉3min;然后用結合有FITC的鬼筆環肽(5μg/ml)在37℃避光的條件下處理50min，最后用50μg/ml的碘化丙啶同樣在37℃避光的條件下處理5min，PBS充分漂洗。經過染色的水凝膠材料馬上用熒光正置相差顯微鏡觀察并攝片。(5)成骨前體細胞的早期黏附和增殖能力檢測:組裝有多肽水凝膠的96孔細胞培養板接種細胞后培養一定的時間，于設定的時間點取出接著每孔加入200μl檸檬酸緩沖溶液，置于－80℃低溫冰箱保存。等樣品收集完畢，用反復凍融法將所有的樣品連續凍融3次，收集細胞裂解液，離心，取上清液用于細胞DNA含量測定。本研究采用特定的試劑盒檢測總的細胞DNA含量來推測細胞數。根據廠家提供的檢測說明，20μl上清液置于96孔細胞培養板中，再用80μl TE工作液稀釋，接著加入100μl picoGreen工作液，避光室溫孵育2～5min，多光譜酶標儀測量熒光強度(Ex485nm/ Em510nm)。最后，根據標準曲線求出待測樣品DNA的含量。(6)堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OC)含量的測定:成骨前體細胞在水凝膠表面分別培養4、7和14天，棄去細胞培養基，用PBS清洗3遍，加細胞裂解液4℃作用15min，收集后12000r/ min 4℃離心15min，取上清。所有樣本分別用專用試劑盒檢測ALP活性和細胞總蛋白濃度。細胞內ALP活性值均用相應的細胞總蛋白濃度予以校準，以獲得相對ALP活性值。關于細胞分泌的骨鈣素主要是通過測量細胞培養基中的骨鈣素含量來確定的。當培養14天后，收集全部的細胞培養基并記錄其體積(ml)，10000r/min 4℃離心15min，取上清測量骨鈣素含量。通過特定的骨鈣素含量測定試劑盒、采用ELLISA的方法來測定，完全依據試劑商提供的操作步驟進行。所測的骨鈣素含量乘以細胞培養基的量得到細胞分泌的骨鈣素總量，最后用細胞總蛋白濃度校準。(7)成骨相關基因表達的檢測:在成骨培養基中分別培養了4、7和14天后，棄去培養基，PBS清洗3遍，用RNeasy Mini Kit和RNase－Free'DNase Set試劑盒抽提細胞總RNA，經反轉錄反應合成相應cDNA后，配制實時定量PCR反應體系(共20μl體積)，進行實時熒光定量PCR檢測(反應參數均根據試劑盒使用說明)，主要為:95℃，5min 1次循環; 95℃，5s及60℃，34s，共40次循環。管家基因β－actin的表達水平為內參照，對各基因表達水平進行校準。各基因引物情況見表1。(8)茜素紅染色檢測鈣化結節:MC3T3－E1細胞在RADA16多肽水凝膠支架材料表面誘導培養4周后，先吸走全部培養基，接著用PBS沖洗3次，然后在95%的乙醇溶液中固定10min。固定后的細胞用去離子水漂洗2次，接著使用40mmol/L的茜素紅溶液(用氨水調至pH 4.2)在室溫下染色10min，在倒置相差顯微鏡下觀察和攝片。

表1 實時定量PCR所用引物的信息

結果

1．多肽水凝膠超微結構的觀察結果:如圖1A所示，多肽水凝膠材料RADA16具有三維網狀結構，由大量的納米纖維結構組成。納米纖維的直徑約為10nm，納米纖維所形成的網狀結構的網孔大小不一，大的有數百納米，而小的網孔大約只有數十納米。圖1B是MC3T3－E1細胞在RADA16水凝膠材料表面培養3天的SEM圖，很明顯成骨細胞能夠在水凝膠支架材料表面伸展、生長。

圖1 多肽水凝膠及成骨細胞在水凝膠表面生長的掃描電鏡圖

2．多肽水凝膠表面細胞形態的觀察結果:如圖2所示，培養1h后，MC3T3－E1細胞就開始在多肽水凝膠表面黏附伸展，可以觀察到許多細小的細胞偽足;到3h時，細胞鋪展的面積明顯增大，可以觀察到許多粗大的細胞偽足;培養24h后，材料表面的細胞基本上完全伸展，呈現出細長的形態。而培養3天后，成骨前體細胞明顯開始分裂增殖，材料表面有大量的細胞重疊生長。

圖2 Mc3T3－E1細胞在多肽水凝膠表面培養不同時間的形態學變化

3．多肽水凝膠表面成骨細胞黏附、增殖能力的檢測結果:培養1h時，接種的大部分成骨前體細胞已經黏附到多肽水凝膠表面，3h時更多的細胞黏附在材料表面;而到了24h，幾乎所有當初接種的細胞全部都黏附到了材料的表面。培養3天后，多肽水凝膠支架材料的表面的細胞增殖到了原來的3倍多，而到第7天，細胞快速增殖了8．5倍。

4．成骨分化相關的蛋白與基因的表達結果:如圖3所示，在多肽水凝膠支架材料表面生長的成骨細胞能夠表達堿性磷酸酶(ALP，成骨細胞分化的早期指標)，而且其活性隨著培養時間的延長而不斷增加。誘導培養2周后，細胞培養液中也能夠檢測到骨鈣素的存在(OC，成骨細胞分化的晚期指標)。而關于成骨分化相關基因Runx2、OSX、AKP－2和OC，不僅能夠檢測到它們的高表達，而且它們的表達量都隨著細胞培養時間的增加而不斷的提高。

圖3 在RADA16多肽水凝膠支架材料表面培養的成骨細胞能夠表達堿性磷酸酶(A)和骨鈣素(B)

5．茜素紅染色的檢測結果:茜素紅染色通常用于檢測細胞外的鈣鹽沉積，RADA16支架表面MC3T3－E1細胞誘導培養4周經茜素紅染色后在水凝膠表面可見許多紅染的區域，說明成骨細胞能夠在RADA16多肽水凝膠材料表面礦化沉積形成鈣結節。

討論

目前，學者們已經發現和設計合成了一系列特殊的低分子多肽，它們能夠自組裝形成結構規整的納米纖維和支架材料。多肽水凝膠支架材料具有良好的生物相容性，能夠支持細胞的黏附和生長［6～8］。多肽水凝膠不僅能用于各種細胞的三維培養，而且能夠促進局部血管的生成［9］。與現有的支架材料相比，分子自組裝多肽水凝膠支架材料具有明顯的優勢。首先，多肽水凝膠材料具有納米三維結構，與天然細胞外基質類似，能為細胞生長提供真正的三維環境。同時，水凝膠材料能在體內被相關酶降解為天然氨基酸，能為人體重吸收利用。最后，它們能夠人工合成，能夠在氨基酸水平改性從而得到更有活性的材料，而且沒有免疫原性避免了排斥反應。本研究證實，1%的RADA16水溶液確實在一定條件下能夠分子自組裝形成水凝膠材料。RADA16多肽是由親水氨基酸和疏水氨基酸交替形成的極其穩定的折疊結構，然后可自組裝成納米纖維支架的水凝膠。SEM分析證實RADA16水凝膠的微觀結構為納米纖維組成的三維結構，成骨前體細胞MC3T3－E1能夠在其上良好的生長，有大量的細胞偽足長入了水凝膠材料的內部，顯示了良好的生物相容性。

本研究的實驗結果顯示，MC3T3－E1細胞能夠在RADA16水凝膠材料的表面黏附，伸展和增殖。成骨前體細胞在RADA16表面生長一段時間后能夠表達ALP、OC蛋白和形成鈣化結節，而ALP、OC和鈣化結節分別是成骨細胞分化的早期、晚期指標和終末指標，這也說明MC3T3－E1細胞能夠在RADA16表面分化和功能表達［10，11］。Runx2與OSX共同調控著ALP、OC、Colla1、OPN、BSP等基因的表達，不僅影響成骨細胞的分化，而且也調節者成骨細胞的功能。而本研究的結果表明，在RADA16表面生長的成骨細胞能夠表達Runx2、OSX、ALP及OC等成骨分化相關基因，而且它們的表達量隨著時間的延長而不斷提高。這也從另一方面說明在RADA16水凝膠支架材料表面生長的MC3T3－E1細胞能夠進行成骨分化和功能表達。

自組裝多肽水凝膠納米纖維支架材料近年來越來越受到學者們的關注，這些特殊的0．1%～1．0%多肽溶液在一定的pH值和離子濃度下能夠自發地自組裝成水凝膠。同時這類多肽水凝膠含有超過99%的水容量，由直徑約為10nm的纖維組成三維網狀結構，內部的孔隙大小為5～200nm。我們認為，這種多肽水凝膠材料將會在牙科領域得到廣泛的應用，特別是牙周疾病引起的骨質缺損的修復治療。因為這類骨質缺損的形狀往往是極不規則的，而且缺損骨質的體積相對較小。多肽水凝膠材料高度含水(≥99%)，凝膠形成前的水溶液狀態能夠填滿任何形狀的骨質缺損空間，然后自組裝形成凝膠充滿整個缺損間隙。雖然多肽水凝膠的力學強度相對較弱，但是當位于牙根周圍時它不會受到很大的外力作用。多肽水凝膠的這種原位自組裝性質是非常關鍵的，因為其他絕大部分的生物材料并不能與炎癥或外傷所致的不規則缺損形狀相匹配。最近有研究認為，多肽水凝膠材料還是一種良好的緩釋載體系統［12］，如果在水凝膠內部攜帶BMPs或抗生素，相信對牙周病的治療大有裨益。

1Kopesky PW，Vanderploeg EJ，Sandy JS，et al．Self－assembling peptide hydrogels modulate in vitro chondrogenesis of bovine bone marrow stromal cells［J］．Tissue Eng Part A，2011，16(2):465－477

2Phillips MJ，Otteson DC．Differential expression of neuronal genes in Muller glia in two－and three－dimensional cultures［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(3):1439－1449

3Zhao M，Song C，Zhang W，et al．The three－dimensional nanofiber scaffold culture condition improves viability and function of islets［J］．J Biomed Mater Res A，2011，94(3):667－672

4Zhou M，Smith AM，Das AK，et al．Self－assembled peptide－based hydrogels as scaffolds for anchorage－dependent cells［J］．Biomaterials，2009，30(13):2523－2530

5Holmes TC，de Lacalle S，Su X，et al．Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self－assembling peptide scaffolds［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97(12):6728－6733

6Galler KM，Aulisa L，Regan KR，et al．Self－assembling multidomain peptide hydrogels:designed susceptibility to enzymatic cleavage allows enhanced cell migration and spreading［J］．J Am Chem Soc，2011，132(9):3217－3223

7Ozeki M，Kuroda S，Kon K，et al．Differentiation of bone marrow stromal cells into osteoblasts in a self－assembling peptide hydrogel:in vitro and in vivo studies［J］．J Biomater Appl，2011，25(7):663－684

8Genove E，Shen C，Zhang S，et al．The effect of functionalized selfassembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function［J］．Biomaterials，2005，26(16):3341－3351

9Davis ME，Motion JP，Narmoneva DA，et al．Injectable self－assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells［J］．Circulation，2005，111(4):442－450

10Fung SY，Yang H，Chen P．Sequence effect of self－assembling peptides on the complexation and in vitro delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine［J］．PLoS One，2008，3(4):e1956

11Bancroft GN，Sikavitsas VI，van den Dolder J，et al．Fluid flow increases mineralized matrix deposition in 3D perfusion culture of marrow stromal osteoblasts in a dose－dependent manner［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(20):12600－12605

12Nagai Y，Unsworth LD，Koutsopoulos S，et al．Slow release of molecules in self－assembling peptide nanofiber scaffold［J］．J Control Release，2006，115(1):18－25

(收稿:2011－09－18)

(修回:2011－12－01)

Study of Osteoblast Cultured on the Surface of RADA16 Self－assembling Peptide Hydrogel．

Zhang Feng，Ren Lingfei，Ying Yongfang，Shi Gengsheng．Taizhou Hospital of Zhejiang Province，Zhejiang 317100，China

ObjectiveTo investigate the ability of attachment，spreading，proliferation and differentiation of mouse pre－osteoblasts，MC3T3－E1，on RADA16 self－assembling peptide hydrogel．MethodsRADA16 peptide was custom synthesized．RADA16 peptide hydrogel was prepared and SEM was used to explore its ultra－structure．Then，MC3T3－E1 cells were seeded on RADA16 peptide hydrogel．Cell attachment，cell spreading，cell proliferation and cell differentiation were evaluated．ResultsMC3T3－E1 cells adhered and spread well on RADA16 peptide hydrogel．High ALP activity，OC production，calcium depositon and expressions of bone－related genes(Runx2，OSX，AKP－2，OC)were detected，and their expressions were increased with the culture time．ConclusionSelf－assembling peptide scaffold can support pre－osteoblast attachment，spreading，proliferation and differentiation and show good compatibility．This kind of peptide scaffold might have a wide application in dentistry，especially the treatment of bone defects caused by periodontal disease．

Peptide hydrogel;RADA16;Osteoblast

牙周病是人類口腔中兩大最常見的疾病之一，也是成年人牙齒缺失的首要原因。根據2005年第3次全國口腔健康流行病學調查結果顯示:我國80%～97%的成年人患有不同程度的牙周疾病。牙周病的治療方法不少，但是牙周組織的恢復尤其是牙周支持骨的恢復一直沒有得到很好的解決。最近有一種新型的多肽自組裝納米纖維支架材料被廣泛用于細胞培養和組織修復［1～4］。這些低分子多肽水溶液(0.1%～1.0%)，能夠在一定條件下(溫度、pH值、離子濃度等)自發的形成穩定的和具有一定強度的水凝膠支架材料［5］。根據這種特性，可以使之在體外為溶液狀態而在體內為凝膠狀態，從而實現可注射性。由于牙周病引起的骨組織缺損形狀復雜且非常不規則，可注射水凝膠修復材料具有尤其明顯的優越性，通過注射的方法將具有一定流動性的生物材料種植體內，原位成型，因此很容易充滿整個具有不規則形狀的缺損部位，手術創傷非常微小。

2007年浙江省科技廳基金資助項目(2007C 23016)

317100臨海，浙江省臺州醫院

施更生，電子信箱:painfulzf@yahoo．cn