維生素D受體基因型、單體型與乳腺癌發病風險的相關性研究

黃友澤 陸紅 白永恒 陳以勒 曾云祥 潘貽飛

維生素D受體基因型、單體型與乳腺癌發病風險的相關性研究

黃友澤 陸紅 白永恒 陳以勒 曾云祥 潘貽飛

目的探討維生素D受體(VDR)基因型、單體型與乳腺癌發病風險關系。方法選取146例乳腺癌患者和320例非癌女性對照人群為研究對象，應用PCR－RFLP檢測VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點的多態性，采用ELISA檢測血漿中1，25(OH)2D3含量，結果用SPSS 13．0軟件進行分析。結果3個位點中僅rs7975232基因型與乳腺癌發病相關。與純合子GG相比，雜合子基因型TT具有較低的發病風險(P=0．001，OR=0．460，95%CI:0．286～0．740)。但不同的基因型之間1，25 (OH)2D3含量并無差異。此外，單體型AGT在病例組分布頻率為3．8%，顯著高于對照組的分布頻率(0．8%，P=0．002);而單體型GTT在病例組的分布則顯著低于對照組(19．8%vs 26．7%，P=0．018)。結論VDR基因與乳腺癌發病存在一定相關;攜帶單體型GTT的女性具有較低的患乳腺癌風險，而單體型AGT則發病風險較高。

維生素D受體單體型基因型乳腺癌

對象與方法

1．研究對象:收集溫州醫學院附屬第一醫院2009年3月～2010年5月住院后經病理確診的146例乳腺癌患者，年齡分布為28～78歲，平均年齡為50．7歲。同時選取同期320例在該院進行健康體檢的女性作為對照人群，對照人群均無相關臨床癥狀，無腫瘤和遺傳病史。對照組年齡為22～84歲，平均年齡為44．9歲。所有患者及健康對照人群均為漢族，且無血緣關系。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有受試對象或家屬均知情同意。

2．研究方法:(1)標本采集、血漿分離和總DNA提取:抽取乳腺腫瘤患者和健康人群用EDTA·K2抗凝的外周血5ml，用全血DNA提取試劑盒(飛捷生物公司)提取全基因組DNA，置于－20℃保存，備用。(2)引物設計和基因分型:根據文獻報道設計引物，由上海捷瑞生物公司合成［3］。PCR反應體系:10×EasyTaq Buffer 5μl，25mmol/L的MgCl20．5μl，各含25mmol/L的dNTP混合液0．5μl，10μmol/L的引物P1和P2各0．4μl，80～200ng DNA模板，5U/μl的EasyTaq DNA聚合酶0．25μl(TransGen Biotech)，加水至50μl。PCR退火溫度、引物序列和酶切條件見表1。隨機篩選部分樣本送公司測序進行突變驗證。(3)1，25(OH)2D3含量檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿中1，25(OH)2D3水平，即用抗人1，25 (OH)2D3單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的1，25 (OH)2D3與單抗結合，加入酶標抗體，形成免疫復合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現藍色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測OD值。1，25(OH)2D3濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中1，25(OH)2D3濃度。

表1 PCR－RFLP技術分析VDR基因多態性引物和酶切條件

3．統計學方法:對照人群的3個位點基因型進行Hardy－Weinberg平衡檢驗，采用非條件Logistic回歸分析基因型、等位基因在病例對照中的分布差異;采用兩樣本t檢驗分析不同基因型間1，25(OH)2D3含量差異。應用SHEsis平臺評價VDR單體型分布差異，結果用P＜0．05作為判定統計上差異的標準［4］。

結果

1．乳腺癌和對照組VDR基因型和等位基因分布情況:圖1顯示rs1544410、rs7975232和rs731236位點的基因型電泳和測序結果。對照人群VDR基因3個位點的基因型進行Hardy－Weinberg平衡檢驗，檢測得到基因型的觀察值與預期值差異均無統計學意義，提示收集的樣本具有群體代表性。此外，研究發現rs731236位點多態性與乳腺癌相關，見表2。與野生型純合子GG相比，雜合子基因型TT在病例對照中的分布具有統計學差異(P=0．001)，經過年齡校準的OR=0．460，95%CI:0．286～0．740。

圖1 VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點的基因型電泳圖和測序結果圖

2．VDR基因型與血漿中1，25(OH)2D3的關系:隨機挑選了90例病例組和90例對照人群檢測血漿中的1，25(OH)2D3含量，結果顯示病例組中其含量為524．83±380．45pmol/ml，明顯低于健康對照人群中1，25(OH)2D3的含量(781．45±373．05pmol/ml，P=0．041)，但不同基因型之間1，25(OH)2D3的含量則無統計學意義(數據未列出)。

表2 乳腺癌和對照組VDR基因型和等位基因分布情況［n(%)］

3．VDR基因單體型分析:SHEsis軟件顯示VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236點存在較強連鎖不平衡現象。對人群進行分析發現VDR基因以單體型GGT為主，GTT次之，而單體型AGC和GGC分布最少，如表3所示。本研究顯示單體型AGT在病例組中分布頻率為3．8%，明顯高于對照組中的分布頻率(0．8%，P=0．002);而單體型GTT在病例組中分布頻率(19．8%)則明顯低于對照組(26．7%，P= 0．002)。單體型結果提示攜帶有GTT單體型的女性具有較低的患乳腺癌風險(OR=0．666)，而AGT單體型則發病風險較高(OR=4．632)。

討論

活性維生素D及其衍生物在體內對靶細胞的生理生化效應，不僅表現在調節骨骼、腸道的鈣磷代謝，調節機體的免疫力，同樣也表現在對腫瘤細胞的增殖和凋亡的調控作用。研究顯示血清中低水平的1，25 (OH)2D3與乳腺癌的進展相關，這可能是通過關鍵分子維生素D受體(VDR)的介導，進而誘導細胞凋亡或經由RB－E2F通路來抑制乳腺癌細胞的增殖或轉移來實現的［5］。此外，免疫組織化學結果顯示VDR蛋白不僅在70%～90%的乳腺癌組織中有表達，并且在不同癌細胞系中表達水平不一樣［6］。鑒于VDR結構和(或)功能，以及血循環中維生素D的水平可潛在地受VDR基因多態性的影響，故VDR的基因多態性與乳腺癌易感性的關系備受關注。

rs1544410(BsmI)、rs7975232(ApaI)和rs731236 (TaqI)位點是VDR基因最常見的SNP位點，均位于VDR基因3'末端，該區域的基因變異呈現出連鎖不平衡現象，并且潛在地與VDR mRNA的表達水平相關［7］。多數學者認為rs1544410位點A等位基因的存在能降低乳腺癌的發病或轉移風險。在英國和美國婦女中，攜帶有rs1544410 GG基因型分別會增加1．92和1．53倍發生乳腺癌的風險［8，9］。若血清1，25 (OH)2D3水平低于50nmol/L同時攜帶rs1544410 GG基因型的女性發生乳腺癌的風險則會增加到6.82倍［10］。對于rs731236位點，Lundin等［11］認為CC基因型患者的病死率(22%)遠低于TT型(41%)或CT型(44%)的病人，且TT型病人的癌腫發生淋巴轉移的危險比攜帶C等位基因的患者明顯增加。本研究以浙江地區漢族婦女作為研究對象，未發現該兩個基因型與乳腺癌相關，但發現rs7975232位點與乳腺癌相關，攜帶有TT基因型的人群較GG基因型患乳腺癌的風險低。我們的研究與來自于澳大利亞的研究結果相符，后者揭示G等位基因或GG基因型可以增加乳腺癌的患病率［12］。此外，單體型研究也發現GTT具有較低的患乳腺癌風險，而單體型AGT則發病風險較高。

此外，研究發現血漿中1，25(OH)2D3含量與基因型分布頻率差異并無直接相關，提示基因型差異可能通過其他某種途徑實現其對乳腺癌細胞的影響。然而本研究還存在一些不足，如研究還缺乏評價女性患者的絕經狀態、ER和PR表達情況，另外，樣本和分析的位點數量不足，未對多個人群進行橫向比較研究等，相信做好這些方面才可得到更準確的結論。

1Cai Q，Shu XO，Jin F，et al．Genetic polymorphisms in the estrogen receptor alpha gene and risk of breast cancer:results from the Shanghai Breast Cancer Study［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2003，12(9):853－859

2Chen WY，Bertone Johnson ER，Hunter DJ，et al．Associations between polymorphisms in the vitamin D receptor and breast cancer risk［J］．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(10):2335－2339

3Bai Y，Yu Y，Yu B，et al．Association of vitamin D receptor polymorphisms with the risk of prostate cancer in the Han population of Southern China［J］．BMC Med Genet，2009，10:125

4Shi YY，He L．SHEsis，a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium，haplotype construction，and genetic association at polymorphism loci［J］．Cell Res，2005，15(2):97－98

5Hutchinson PE，Osbome JE，Lear JT，et al．Vitamin D receptor polymorphisms，associated with altered prognosis in patients with malignant melanoma［J］．Clin Cancer Res，2000，6(2):498－504

6Lyakhovich A，Aksenov N，Pennanen P，et al．Vitamin D induced up－regulation of keratinocyte growth factor(FGF－7/KGF)in MCF－7 human breast cancer cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，273(2):675－680

7John EM，Schwartz GG，Koo J，et al．Sun exposure，vitamin D receptor gene polymorphisms，and risk of advanced prostate cancer［J］．Cancer Res，2005，65(12):5470－5479

8Curran JE，Vanghan T，Lea RA，et al．Association of A vitamin D receptor polymorphism with sporadic breast cancer developmemt［J］．Int J Cancer，1999，83(6):723－726

9Ludin AC，Soderkvist P，Eriksson B，et al．Association of breast cancer progression with a vitamin D receptor gene polymorphism［J］．South－East Sweden Breast Cancer Group．Cancer Res，1999，59 (10):2332－2334

10Guy M，Lowe LC，Bretherton－Watt D，et al．Vitamin D receptor gene polymorphisms and breast cancer risk［J］．Clin Cancer Res，2004，10(16):5472－5481

11Trabert B，Malone KE，Daling JR，et al．Vitamin D receptor polymorphisms and breast cancer risk in a large population－based casecontrol study of Caucasian and African－American women［J］．Breast Cancer Res，2007，9(6):84

12Lowe LC，Guy M，Mansi JL，et al．Plasma 25－hydroxy vitamin D concentrations，vitamin D receptor genotype and breast cancer risk in a UK Caucasian population［J］．Eur J Cancer，2005，41(8):1164－1169

(收稿:2012－01－05)

(修回:2012－02－17)

Relationship between Genotypes and Halpotypes of Vitamin D Receptor Gene and Breast Cancer Risk．

ObjectiveTo investigate the relationship between genotypes and halpotypes in the vitamin D receptor(VDR)gene and breast cancer risk．MethodsSamples were collected from 146 breast cancer patients and 320 non－cancer female controls．The genotypes were detected by PCR－RFLP and confirmed by sequencing．The levels of plasma 1，25(OH)2D3were measured by ELISA．The association between genotype and allelic frequencies with protein levels were calculated and analyzed by SPSS 13．0 software．ResultsOf three SNPs，only rs7975232 TT was shown to associate with 0．46－fold risk of breast cancer．No association of VDR genotypes and the levels of plasma 1，25(OH)2D3were found．Additionally，the frequency of haplotype AGT was 3．8%in cases，significantly higher than that in controls(0．8%，P=0．002)．However，the frequency of haplotype GTT in cases were significantly lower than that in controls (19．8%vs 26．7%，P=0．018)．ConclusionVDR gene polymorphisms are related to breast cancer risk．Individuals with haplotype GTT show lower risk，but the individuals with halpotype AGT have higher risk．

Vitamin D receptor;Genotype;Haplotype;Breast cancer

Huang Youze，Lu Hong，Bai Yongheng，et al．The 8th People Hospital of Wenzhou City，Zhejiang 325000，China

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，但其發病的確切分子機制到目前為止尚未清楚。近年來發現，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)可能在乳腺癌的病因學中起著重要的作用［1，2］。本研究擬通過分析VDR基因3'端UTR區域rs1544410、rs7975232和rs731236點的基因型、等位基因和單體型，并檢測血漿中1，25(OH)2D3含量，旨在從遺傳功能學角度探討其與乳腺癌遺傳易感性的關系，從而有助于了解疾病的發病機制。

溫州市鹿城區科技計劃項目(S10106)

325000溫州市第八人民醫院檢驗科(黃友澤、陳以勒、曾云祥);溫州醫學院附屬第一醫院實驗診斷中心(陸紅);外科實驗室(白永恒、潘貽飛)

白永恒，電子信箱:greatsailor@163．com