參附注射液對腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素、小腸黏膜HSP－70表達的影響

胡培陽 胡曉飛 屠巍巍 陳中明 何露莎 王果

參附注射液對腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素、小腸黏膜HSP－70表達的影響

胡培陽 胡曉飛 屠巍巍 陳中明 何露莎 王果

目的探討參附注射液對腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平、小腸黏膜熱休克蛋白－70(HSP－70)的表達及腸黏膜屏障功能的影響。方法健康雄性SD大鼠60，隨機分為假手術(shù)組、腹腔感染組和參附注射液組，每組20只。假手術(shù)組僅行單純剖腹手術(shù);感染組采用盲腸結(jié)扎加穿孔(CLP)手術(shù)制作嚴重腹腔感染模型;參附注射液組行CLP后以參附注射液［10ml/(kg·d)］靜脈注射。術(shù)后第5天，統(tǒng)計各組大鼠的死亡率，檢測血內(nèi)毒素水平、小腸黏膜HSP－70表達，并作小腸黏膜Chiu評分。結(jié)果參附注射液組大鼠死亡率明顯低于腹腔感染組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。與腹腔感染組相比，參附注射組大鼠血內(nèi)毒素水平顯著降低(P＜0．05)，小腸黏膜HSP－70表達明顯升高(P＜0．05)，小腸黏膜Chiu氏評分也較低(P＜0．05)。結(jié)論參附注射液可降低腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平，促進腸黏膜細胞HSP－70的表達，保護腸黏膜的屏障功能，從而降低腹腔感染大鼠的死亡率。

參附注射液SD大鼠內(nèi)毒素腸黏膜屏障熱休克蛋白－70

材料與方法

1．實驗材料:實驗動物為清潔級健康雄性SD大鼠60只，體重200～250g，8周齡，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供［合格證號:SYXK(浙)2008－0115］。參附注射液購自雅安三九藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號為國藥準字Z090202)。內(nèi)毒素檢測用顯色基質(zhì)鱟試劑盒(終點顯色法，含偶蛋化試劑)購自廈門市鱟試劑廠有限公司(批號:090808)。HSP－70免疫組化相關(guān)試劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。高清晰度病理圖像分析系統(tǒng)由同濟科技集團千屏影像工程公司提供。

2．動物分組與造模:取健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成假手術(shù)組，腹腔感染組和參附注射液組，每組20只。參附注射液組采用盲腸結(jié)扎加穿孔手術(shù)(cecum ligation and perforation，CLP)制作嚴重腹腔感染模型行，術(shù)后予參附注射液［10ml/(kg·d)］靜脈注射5天，每天1次［3］;感染組同樣采用CLP制作嚴重腹腔感染模型，假手術(shù)組僅行單純剖腹手術(shù);后兩組術(shù)后均予生理鹽水［10ml/(kg·d)］靜脈注射5天，每天1次。

3．標本采集:術(shù)后第5天，存活的SD大鼠予3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，抽取下腔靜脈血其中1ml與配套血液抗凝劑1ml混勻后置于冰水中，以1000r/min低溫離心10min，取其上清用于內(nèi)毒素檢測。取Treits韌帶下約15～20cm處一段小腸組織，固定切片后用于觀察腸黏膜病理變化和小腸黏膜HSP－70蛋白表達檢測。

4．血清內(nèi)毒素檢測:采用偶氮終點顯色法鱟試驗(LAL)定量測定血漿內(nèi)毒素的濃度，WSOFTMAX軟件處理內(nèi)毒素標準品溶液得到的OD值，自動計算待測樣品內(nèi)毒素含量。

5．小腸黏膜損傷程度評定:小腸標本部分行常規(guī)石蠟切片，HE染色，根據(jù)Chiu氏6級評分對小腸的損傷程度進行評定，雙盲法判讀腸黏膜病理切片并記分［4］。0分:正常黏膜絨毛;1分:上皮下間隙增大，通常在絨毛的尖端，常伴隨有毛細血管淤血;2分:上皮下間隙擴張伴隨上皮層同固有層的中度分離;3分:絨毛兩側(cè)上皮層大量的同固有層分離，部分絨毛頂端破損;4分:絨毛破損伴隨固有層毛細血管暴露，可能觀察到固有層的細胞成分增多;5分:固有層破壞和不完整、出血和潰瘍。

6．小腸黏膜HSP－70蛋白檢測(免疫組化法):另一部分小腸組織切片脫蠟至水，微波修復(5min×2次)，室溫冷卻，3%H2O2封閉30min，PBS沖洗后(5min×2次)，羊血清封閉30min(37℃水浴)，滴加HSP－70抗體37℃水浴30min，PBS沖洗(5min×2次)，滴加Ⅱ抗(羊抗鼠)37℃水浴30min，再行PBS沖洗(5min×2次)，DAB顯色5～10min，蘇木精淡染，0.1%鹽酸、乙醇分化，返藍，脫水、透明、中性樹膠封片。陽性反應(yīng)為細胞染成棕黃色或有棕黃色顆粒沉積。

陽性細胞計數(shù)方法:采用雙盲法在每張切片中選取有代表性的區(qū)域，在高倍鏡(10×40)下計數(shù)1000個細胞中的陽性細胞數(shù)(輔以計算機圖像分析軟件IPP6．0自動進行統(tǒng)計計數(shù))，每組數(shù)值以均數(shù)±標準差表示。個別壞死細胞及周邊著色細胞不計入陽性細胞內(nèi)。

7．統(tǒng)計學方法:采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。本實驗計量資料以采用完全隨機設(shè)計的方差分析，組間比較采用SNK－q檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差±s)表示，計數(shù)資料采用行×列表卡方檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1．大鼠實驗后死亡情況(表1):假手術(shù)組術(shù)后5天均未出現(xiàn)死亡，死亡率為0%;腹腔感染前3天共死亡10只，總死亡率為50%;參附注射液組前3天共死亡4只，總體死亡率為20%。與假手術(shù)組相比，腹腔感染組大鼠死亡率顯著升高(P＜0．01)。而采用參附注射液治療后，參附注射液組大鼠死亡率與生理鹽水治療的腹腔感染組大鼠死亡率比較略有降低(P＜0．05)。

表1 3組大鼠在24、48、72h內(nèi)死亡數(shù)及死亡率

2．3組間內(nèi)毒素水平比較(表2):術(shù)后第5天，腹腔感染組內(nèi)毒素含量明顯高于假手術(shù)組和參附注射液治療組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);參附注射液組內(nèi)毒素水平雖較假手術(shù)組高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。

表2 3組術(shù)后第5天血內(nèi)毒素水平比較

3．小腸黏膜Chiu氏評分(圖1、表3):假手術(shù)組小腸黏膜病理大多表現(xiàn)為正常絨毛(Chiu氏評分:0分)，腹腔感染組小腸病理以絨毛上下皮間隙增大為主(Chiu氏評分:1分)，參附注射液治療組小腸多表現(xiàn)為正常絨毛和絨毛上下皮間隙增大。3組均未見絨毛兩側(cè)上皮層大量的同固有層分離，部分絨毛頂端破損;絨毛破損伴隨固有層毛細血管暴露，固有層的細胞成分增多;固有層破壞和不完整、出血和潰瘍等病理表現(xiàn)。

圖1 小腸黏膜Chiu氏評分(HE染色)

表3 大鼠小腸黏膜病理Chiu氏評分及10×40倍下各組大鼠1000個腸黏膜細胞中HSP－70陽性細胞數(shù)

4．各組大鼠腸黏膜HSP－70的表達(圖2、表3):顯微鏡下所見:腹腔感染組和參附注射液組的大鼠小腸黏膜HSP－70表達主要集中在固有層的淋巴細胞，黏膜下層結(jié)締組織及成纖維細胞中也有陽性表達。參附注射液組HSP－70表達陽性者多為整個細胞染成棕黃色，而對照組及假手術(shù)組則多見陽性細胞中黃色顆粒，見圖2。與假手術(shù)組相比，參附注射液組腸黏膜HSP－70表達顯著升高(P＜0．05)，而腹腔感染組HSP－70表達表達略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義。并且，與腹腔感染組大鼠相比，參附注射液組腸黏膜HSP－70的表達差異仍有統(tǒng)計學意義。

圖2 3組大鼠小腸黏膜HSP－70表達情況(蘇木素染色，×100)

討論

腹腔感染是普通外科常見疾病之一，多繼發(fā)于腹腔內(nèi)臟器炎癥穿孔、損傷破裂或手術(shù)后并發(fā)癥等。嚴重腹腔感染可引起腸黏膜屏障損傷，腸道細菌易位，繼發(fā)細胞因子和炎性介質(zhì)的連鎖反應(yīng)，導致感染性休克甚至多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。

內(nèi)毒素是革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的一種重要產(chǎn)物，腹腔感染膿毒癥時，其水平可明顯升高。內(nèi)毒素可以抑制腸道的蠕動、分泌、消化和免疫防御作用，引起黏膜水腫，使腸絨毛頂部細胞壞死，腸通透性增加，從而破壞腸黏膜屏障功能。內(nèi)毒素還可以激活補體、激活血液凝固，通過產(chǎn)生刺激血管的激素和激活巨噬細胞的IL－1損害腸屏障［5］。在本研究中，筆者觀察到假手術(shù)組小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列整齊，而腹腔感染組腸黏膜下層間質(zhì)水腫、血管充血，腸絨毛毛細血管充血，部分區(qū)域有黏膜上皮脫落，漿膜層明顯炎性滲出，腸黏膜的Chiu氏評分假手術(shù)組高，并且腹腔感染組大鼠組血清內(nèi)毒素水平較假手術(shù)組高。本研究的結(jié)果支持內(nèi)毒素對腸黏膜屏障具有破壞作用。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用參附注射液組大鼠腸黏膜病理改變較腹腔感染組有明顯好轉(zhuǎn)，黏膜水腫、上皮壞死等情況減輕，并且內(nèi)毒素水平也較腹腔感染組降低，提示參附注射液可能具有腸黏膜屏障的保護作用。王進等［6］曾運用參附注射液治療內(nèi)毒素所致全身炎癥反應(yīng)綜合征的大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參附注射液可以顯著降低NF－κB活性、TNF－α及IL－6水平，減輕肺臟和肝臟病理損傷，而楊仁軒等［7］對老年髖部圍手術(shù)期患者應(yīng)用參附注射液進行治療時也證實預(yù)防性使用參附注射液能使血漿內(nèi)毒素顯著減低，增強肝臟的解毒功能，直接促進肝臟對內(nèi)毒素的滅活。在缺血再灌注損傷動物模型中，吳洋等［8］研究表明參附注射液能夠激發(fā)血紅素加氧酶(HO－1)的大量生成，抑制誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，維護腸黏膜屏障的作用。結(jié)合以往的研究結(jié)果，筆者提出參附注射液可能通過降低腹腔感染大鼠血內(nèi)毒素水平，抑制炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激，進而起到腸黏膜的保護作用。

腹腔感染后應(yīng)用參附注射液治療還可能影響熱休克蛋白(heat shock protein－70，HSP－70)的表達。業(yè)已證明HSP－70是一種分子伴侶，在細胞的信息傳遞、生長、分化中具有重要的調(diào)控作用，同時HSP－70又具有抗原呈遞而起作用，參與細胞的抗損傷、修復過程。HSP－70通過抑制NF－κB活化，從而抑制免疫應(yīng)答細胞內(nèi)炎癥細胞因子IL－1、IL－2、TNF－α等的轉(zhuǎn)錄，阻斷促炎因子表達，從而抑制炎癥反應(yīng)［9］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腹腔感染組大鼠腸黏膜HSP－70表達與假手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學意義，而參附注射液治療組大鼠HSP－70的表達較假手術(shù)組和腹腔感染組均高，提示參附注射液可能促進腹腔感染大鼠腸黏膜HSP－70的表達，從而發(fā)揮腸黏膜保護作用。

在本研究中，我們還觀察到腹腔感染組大鼠的死亡率明顯高于假手術(shù)組，而應(yīng)用參附注射液治療腹腔感染大鼠后，其死亡率較單純應(yīng)用生理鹽水治療的腹腔感染大鼠死亡率低，這一方面可能與應(yīng)用參附注射液治療能降低內(nèi)毒素水平、對抗內(nèi)毒素性休克，并能改善重癥膿毒血癥時組織氧代謝有關(guān)，另一方面可能與參附注射液能改善腸系膜微循環(huán)，促進腸道黏膜HSP－70的表達，保護腸黏膜屏障有關(guān)［10～12］。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明應(yīng)用參附注射液治療腹腔感染大鼠，可以降低血清內(nèi)毒素水平，促進腸黏膜HSP－70的表達，保護腸黏膜屏障，從而降低腹腔所致的死亡率。

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2王麗亞，魏影非，杜惠蘭，等．參附注射液對腸梗阻術(shù)后患兒腸功能恢復及細胞免疫、血IL－2、TNF－α水平的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23(10):744－746

3鮑揚，李幼生，黎介壽．一種新型腹腔感染動物模型的建立［J］．中華實驗外科雜志，2004，21(1):99－100

4Matsuda H，Hirato J，Kuroiwa M，et al．Histopathological and immunohistochemical study of the enteric innervations among various types of aganglionoses including isolated and syndromic Hirschsprung disease［J］．Neuropathology，2006，26(1):8－23

5Suzuki Y，Lu Q，Xu DZ，et al．Na+，K+－ATPase activity is inhibited in cultured intestinal epithelial cells by endotoxin or nitric oxide［J］．Int J Mol Med．2005，15(5):871－877

6Wang J，Qiao LF，Yang GT．Role of Shenfu injection in rats with systemic，inflammatory response syndrome［J］．Chin J Integr Med，2008，14(1):51－55

7楊仁軒，郭玉海，李念虎，等．參附注射液對老年髖部手術(shù)后腸屏障的保護機制［J］．中醫(yī)正骨，2005，17(12):8－9

8吳洋，夏中元．參附注射液對腸缺血再灌注大鼠腎組織HO－1與iNOS表達的影響［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(7):1024－1027

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12宋欣偉，駱永忠．不同劑量參附注射液對兔心肌缺血再灌注損傷時胃腸微循環(huán)的保護作用［J］．中國臨床康復，2005，9(11):128－129

(收稿:2011－12－29)

(修回:2012－02－16)

Effects of Shenfu Injection on the Serum Endotoxin Level，HSP－70 Expression of Intestinal Mucosa in Rats with Severe Abdominal Infection．

Hu Peiyang，Hu Xiaofei，Tu Weiwei，Chen Zhongming，He Lusha，Wang Guo．VIP Ward，Taizhou Hospital，Zhejiang 317000，China

ObjectiveTo study the effects of Shenfu injection on the serum endotoxin levels，the expression of HSP－70 and intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection．MethodsA total of 60 male SD rats were randomly divided into three groups(n=20 each):control group(1aparotomy only)，infection group(cecal ligadon plus puncture)，and Shenfu group［intravenous injection of Shenfu after cecal ligadon plus puncture，10ml/(kg·d)］．Serum endotoxin levels and the expression of HSP－70 in the intestinal mucosa were measure on the fifth day after the operation．The mortality rate and intestinal pathology Chiu scores were calculated meanwile．ResultsOf the three groups，infection group got the highest mortality，while Shenfu injection can reduce mortality(P＜0.05)．Compared with infection group，serum endotoxin level in the Shenfu injection group was significantly lower(P＜0．05)，the expression of HSP－70 in the intestinal mucosa was significantly increased，and Shenfu injection group got better Chiu's scores(P＜0．05)．ConclusionShenfu injection can reduce the serum endotoxin level，promote the expression of intestinal HSP－70 and protect the intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection，therefore it may play a role in reducing the mortality of rats with abdominal infection．

Shenfu injection;SD rats;Endotoxin;Intestinal mucosal barrier;Heat shock protein－70

嚴重腹腔感染可引起腸黏膜屏障損傷，腸道細菌、內(nèi)毒素易位，導致感染性休克甚至多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，其病死率約為20%～40%。目前嚴重腹腔感染的治療仍是腹部外科中棘手的問題。參附注射液(shenfu injection，SF)為紅參、黑附片提取物的制劑，主要成分是人參皂貳、烏頭類生物堿，中醫(yī)認為其具回陽救逆、益氣固脫的作用，主要用于暴脫的厥脫癥(感染性、失血性、失液性休克等)。現(xiàn)代藥理學認為參附注射液具有抗炎、抗休克、抗氧自由基、改善微循環(huán)、增強機體免疫功能等多種藥理作用。研究提示參附注射液對腸黏膜缺血再灌注損傷及重要臟器具有一定的保護作用，并能夠促進腸梗阻患兒術(shù)后腸功能及免疫功能的恢復，但其在嚴重腹腔感染中的治療作用及機制尚未見文獻報道［1，2］。本研究通過復制SD大鼠嚴重腹腔感染模型，檢測血清內(nèi)毒素水平和腸黏膜細胞熱休克蛋白－70(heat shock protein－70，HSP－70)表達，評估腸黏膜損傷程度來探討參附注射液在嚴重腹腔感染的治療作用。

317200浙江省天臺人民醫(yī)院(胡培陽);317000臨海，浙江省臺州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(胡曉飛);急診科(屠巍巍、陳中明); 311800浙江省諸暨市紅十字醫(yī)院急診科(何露莎);浙江省臺州醫(yī)院特需病房(王果)

胡曉飛，電子信箱:huxiaofei2008@hotmail．com