p63基因亞型的表達對胃癌細胞凋亡的影響

李國勝 王紅巖 劉崢嶸

（遼寧省人民醫院普通外科，遼寧 沈陽 110016）

人類p63基因定位于染色體3q27～29區，在兩個不同的啟動子控制下，編碼兩類轉錄產物：一類為全長型p63（TAp63），能夠反式激活p53靶基因的轉錄并誘導細胞凋亡，具有抑癌基因的活性。另一類為截短型p63（ΔNp63），該類p63由于缺乏酸性N端反式激活區，喪失反式激活p53靶基因以及誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡的功能。本研究通過一系列基因操控實驗來檢測p63基因亞型表達水平的改變對胃癌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌細胞系MKN28

1.1.2 主要試劑

第一抗體（TAp63，ΔNp63）；抗鼠的HRP標記二抗IgG；SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit；Western Blotting Chemiluminescence Luminol Kit；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒；Taq DNA聚合酶 ；無RNase活性的DNase及RNase inhibitor；細胞總蛋白提取蛋白酶抑制劑（aprotinin、Leupetin、PMSF）；限制性核酸內切酶（BamHⅠ、XhoⅠ）

1.1.3 TAp63α和ΔNp63α克隆引物序列

1.1.4 載體

pEGFP-N1 、pGEX-T-easy。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養

常規培養胃癌細胞株MKN28。

1.2.2 RT-PCR擴增TAp63α和ΔNp63α并全長序列克隆入pEGFP-N1載體中，從而構建TAp63α及ΔNp63α的真核表達載體pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α。

1.2.3 利用Lipofectamine 2000轉染方法，分別用pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α轉染MKN28胃癌細胞系，從而構建TAp63α及ΔNp63α的高表達細胞系。合成TAp63及ΔNp63的siRNA oligo。分別將TAp63及ΔNp63的siRNA oligo轉染入MKN28胃癌細胞系，從而構建TAp63及ΔNp63的基因沉默細胞系。提取細胞總蛋白進行western blot檢測TAp63和ΔNp63的表達。

1.2.4 Annexin v/PI染色方法檢測TAp63、ΔNp63高表達或敲除對MKN28凋亡的影響：利用Lipofectamine 2000轉染方法，用pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉染MKN28細胞，轉染72h后，Annexin v/PI檢測細胞凋亡狀況。實驗重復3次，以均值±標準差縱坐標作圖。

1.3 統計學分析

使用SPSS13.0 統計學軟件，采用Student’s t-test進行統計學分析，P＜0.05 認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α克隆，測序證明克隆序列無突變（圖1）。

圖1 pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α的5’端測序結果截圖

2.2 Western blot驗證pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉染效果（圖2）。結果顯示：pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α轉染后，可檢測到外源性TAp63α和ΔNp63α的表達，其分子量略大于內源性TAp63α和ΔNp63α；而TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo轉染后，TAp63和ΔNp63的表達水平明顯下降。

圖2 Western blot驗證pEGFP-N1-TAp63α，pEGFP-N1-ΔNp63α，TAp63 siRNA oligo，ΔNp63 siRNA oligo瞬時轉染效果

2.3 Annexin v/PI染色方法檢測TAp63、ΔNp63高表達或敲除對MKN28細胞凋亡的影響。

結果顯示：TAp63高表達能促進凋亡，在沒有凋亡誘導劑存在的條件下，TAp63敲除對MKN28的凋亡無明顯影響（圖3、圖4）；ΔNp63敲除顯著促進凋亡，在沒有凋亡誘導劑存在的條件下，ΔNp63高表達對MKN28細胞的凋亡無明顯影響（圖3、圖5）。

圖3 TAp63、ΔNp63高表達或敲除對MKN28凋亡的影響

圖4 TAp63高表達或敲除對MKN28凋亡影響

圖5 ΔNp63高表達或敲除對MKN28凋亡影響

3 討 論

p63基因具有與p53基因高度的序列和結構同源性，主要包含p53家族經典的三部分結構：N-末端的轉錄激活區、核心DNA結合區、寡聚化區，所以p63被歸類為p53家族成員，但是二者之間的差異依然十分明顯。也許最主要的差異是p53在腫瘤組織中存在廣泛的突變，而p63的突變卻很少發生；p53只在應激條件下表達水平升高，而p63在人類腫瘤組織中存在高表達，這說明p63可能比p53具有更為廣泛的功能，其表達水平的改變既足以令細胞惡變；p53的表達具有普遍性，而p63的表達卻表現出明顯的組織特異性，尤其是p63的兩個主要亞型的差異更為明顯。這些差異都說明p63相對于p53具有其獨特性。

由于p63基因存在多種同源體，導致其功能的多樣性和復雜性，這主要表現在TA 型和ΔN 型同源體之間存在功能上的差異性。例如：TA型同源體可以結合p53同源序列并誘導p53靶基因的轉錄，如p21，Bax，MDM2 等；在這方面，TAp63γ同源體表現出較強的活性，可以誘導細胞周期抑制和發生凋亡。而TAp63α同源體由于其C未端存在抑制區域SAM，因而基本上不表現出轉錄激活活性。此外，p63基因能夠調節血管內皮生長因子(VEGF)的表達，其中TAp63γ抑制其表達，而ΔNp63α則起促進其表達，這一途徑可能是通過調節缺氧誘導因子HIF21α的穩定性實現的[1]。由于VEGF的表達在人類腫瘤形成中起作用，因此p63還可以通過調控VEGF的表達而發揮抑癌或者原癌基因功能。同時，TAp63γ還能夠抑制內源性表皮生長因子受體（EGFR）的表達，其機制是TAp63γ起到EGFR啟動子的轉錄抑制因子作用[2]。盡管ΔN p63不能誘導轉錄激活，但是由于其具有DNA 結合域，它們可以非優勢的方式參與DNA結合位點的競爭或直接與p53或TAp63結合，從而抑制p53 或TAp63的功能[3-5]。

盡管p63基因與表皮發育的關系已經相對明確，但是p63與腫瘤的關系一直爭議較大。由于p63與p53的同源性，所以早期的研究主要集中在p63與基因組穩定性以及凋亡的關系。在DNA損傷應激后，p63基因表達水平增高，誘導凋亡，這些似乎暗示了p63可能是一個抑癌基因[6]。但是p63作為原癌基因的觀點也受到廣泛的關注。支持此觀點的主要依據是腫瘤組織中存在p63的高表達，尤其是ΔNp63在鱗癌組織中表達水平明顯增高[7,8]。而在原代培養的人皮膚癌細胞中發現了TAp63的表達缺失，但是正常皮膚組織中卻存在TAp63的表達。考慮到ΔNp63可以以顯性負控制的方式抑制p53及TAp63誘導的轉錄激活和凋亡，因此腫瘤組織中的高表達ΔNp63可能是一種選擇性優勢，即后者可能是真正意義的原癌基因[9,10]。

本研究發現TAp63促進胃癌細胞的凋亡，而ΔNp63抑制胃癌細胞的凋亡。這提示在胃癌細胞中，TAp63可能行使抑癌基因的功能，而ΔNp63可能行使癌基因的功能。再一次驗證了TAp63和ΔNp63的功能差異假說。

[1] Senoo M,Matsumura Y,Habus S,et al.Tap63gamma (p51A) and dNp63aipha (p73L),two major isoforms of the p63 gene,exert opposite effects on the vascular endothelial growth factor (VEGF)gene expression[J].Oncogene,2002,21(16)：2455.

[2] Hirotaka N,Makoto S,Katsura HN,et al.p53 homologue p63 represses epidermal growth factor receptor expression[J].J Biol Chem,2001,276(45)：417-417.

[3] Yang A,Kaghad M,Wang Y,et al.p63,a p53 homolog at 3q27-29,encodes multiple products with transactivating,death-inducing,anddominant-negative activities[J].Mol Cell,1998,2(3)：305–316.

[4] Zeng SX,Dai MS,Keller DM,et al.SSRP1 functions as a coactivator of the transcriptional activator p63[J].EMBO J,2002,21(13)： 487-497

[5] Liefer KM,Koster MI,Wang XJ,et al.Roop DR.Down-regulation of p63 is required for epidermal UV-B-induced apoptosis[J].Cancer Res,2000,60(15)：4016-4020.

[6] Serber Z,Lai HC,Yang A,et al. Dotsch V.A C-terminal inhibitory domain controls the activity of p63 by an intramolecular mechanism[J].Mol Cell Biol,2002,22(24)：8601-8611.

[7] Hibi K.AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(10)：5462-5467.

[8] Crook T,Nicholls JM,Brooks L,et al.High level expression of DN-p63：A mechanism for the inactivation of p53 in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma (NPC)? [J].Oncogene,2000,19(30)：3439-3444.

[9] Liefer KM,Koster MI,Wang XJ,et al.Down-regulation of p63 is required for epidermal UV-B-induced apoptosis[J].Cancer Res,2000,60(15)：4016-4020.

[10] Ratovitski EA,Patturajan M,Hibi K,et al.p53 associates with and targets DNp63 into a protein degradation pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4)：1817-1822.