離心—冷凍法制備梯度孔結構的真皮支架

王明波，王 俊，譚榮偉，佘振定

(1.深圳清華大學研究院生物醫用材料及植入器械重點實驗室，廣東深圳 518057；2.深圳蘭度生物材料有限公司，廣東深圳 518057)

離心—冷凍法制備梯度孔結構的真皮支架

王明波1，王 俊1，譚榮偉2，佘振定1

(1.深圳清華大學研究院生物醫用材料及植入器械重點實驗室，廣東深圳 518057；2.深圳蘭度生物材料有限公司，廣東深圳 518057)

膠原基真皮支架的結構和性能受多方面因素影響，比如除膠原外的其他主要材料、支架的孔徑和孔隙率以及交聯度等.采用離心—冷凍法結合冷凍干燥法制備梯度孔結構的真皮支架，表征支架的孔徑和孔隙率，并以細胞培養檢驗其生物相容性，其中采用掃描電鏡對上中下3部分支架結構及孔徑進行表征，并通過細胞培養生長實驗檢測該支架材料的細胞粘附性能，以達到表征離心力的影響.結果顯示，離心力對支架的微觀結構產生了影響，支架的致密程度從下到上有明顯的不同，具體表現在孔徑上:上層孔徑52±27.8μ m，中層孔徑57±8.7μ m，下層孔徑49±40.4μ m.同時，細胞粘附實驗表明，致密的下層更適合細胞的粘附生長.

真皮支架；離心力；生物相容性

0 引 言

皮膚缺損是一類常見但未得到根本性解決的古老醫學問題，而由燒傷、機械損傷和各類疾病等造成的皮膚缺損患者每年達上千萬，因此，探索治療皮膚缺損的方法尋找合適的材料成為一個倍受研究人員關注的課題，而研制出具有生物活性的皮膚代替物，即皮膚再生支架，來永久性地代替受損皮膚在科研和臨床上都具有十分重要的意義[1-2].皮膚組織主要分為表皮層、真皮層和皮下組織3大部分.真皮層未缺損時，表皮層可以自動修復，但一旦真皮層缺損，表皮層則無法再生.可見，真皮層的再生是皮膚組織再生的前提和核心.組織工程技術的發展[3]，為皮膚缺損修復研究開辟了一條新的路徑，近年來，研究人員采用各類可降解材料作為支架材料，已制備出具有永久替代性并引導創傷面組織再生的人工真皮[4-6].

目前，各種各樣的高分子材料被用作組織工程材料[7].皮膚真皮組織中，膠原是主要的細胞外基質，以膠原為基體材料構建人工真皮是較理想的研究方案[8-10].由于膠原作為一種具有良好的生物相容性的可降解材料，而被廣泛應用于組織工程及醫藥領域中[11-13].膠原基真皮支架的構建方法有很多種，其中，基于熱致相分離原理的冷凍干燥法是最常見也是用于本實驗的方案.然而，真皮支架制備過程中，支架的第二組分、支架孔徑和孔隙率、支架厚度以及交聯度等因素對支架的各種性能都起著至關重要的影響，其中孔徑和形貌對其生物活性有比較大的影響[14].Doillon等[15]通過調節冷凍干燥溫度及制備過程中pH值獲取理想的孔徑和形貌結構；Garg等[16]討論了第二組分對膠原基真皮支架結構的影響.在此基礎上，本研究旨在討論離心力在制備過程中對支架結構形貌以及性能產生的影響，同時，通過對上中下3層結構進行相應形貌和生物性能表征得出相關結論.

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

實驗所用的試劑包括:膠原(質量濃度為0.37%)，透明質酸(HA)，膠原酶(SigmaC0130)，冰乙酸(分析純)，其他所用試劑均為分析純.

實驗所用的儀器包括:高速離心機(SIGMA 3-18K)，冷凍干燥機(Scientz-10N)，-80℃冰箱(SANYO/MDF-32V)，掃描電子顯微鏡(Mira3 Xmh，TESCAN)，恒溫搖床(FLY-100B).

1.2 真皮支架的制備

膠原/透明質酸真皮支架采用采用離心—冷凍法結合冷凍干燥法制備，其制備過程為:稱量膠原蛋白0.46 g于100 mL燒杯中，加入0.05 mol/L醋酸溶液49.54 g，攪拌溶解24 h(攪拌速度控制在400～500 rpm)；配制1.5%的透明質酸水溶液，并在攪拌的過程中，將透明質酸水溶液慢速加入上述膠原溶液中；復合溶液置于10 Pa、室溫下真空箱中脫泡10 min，裝入50 mL離心管中，5 000 rpm、-20℃條件下離心15 min，取出，放入-80℃冰箱進行冷凍3 h，開啟冷凍干燥機進行制冷至-45℃；取出樣品放入冷凍干燥機，抽真空至10 Pa，冷凍干燥72 h得到膠原基真皮結構.

1.3 真皮支架材料孔隙率測定

用手術刀從所制備的真皮支架上切取上中下三部分，制成3個0.5 cm3平行樣的樣品，稱量其重量G1.然后，分別浸泡在裝有異丙醇的培養皿中，異丙醇沒過樣品，使樣品充分吸收異丙醇，浸泡12、24、48 h 3個時間段.將飽和試樣放進銅絲網籃，懸掛在注滿異丙醇的燒杯中，稱量飽和試樣在異丙醇中的重量G3.從燒杯中取出試樣，用飽含異丙醇的多層紗布將試樣表面過剩的異丙醇擦掉(注意不壓到試樣，從而吸出空隙中的異丙醇溶液)，迅速稱量飽和試樣在空氣中的重量G2.

根據下列公式(1)和公式(2)分別計算試樣的顯孔隙率和容重.式中，q為試樣的顯孔隙率，DV為試樣的容重，G1為干燥支架試樣重量，G2為飽和支架試樣在空氣中質量，G3為含飽和異丙醇的支架試樣重量.

1.4 真皮支架孔結構表征

分別取干燥的真皮支架試樣上中下3組分直接粘在制樣模具導電膠上，真空條件下噴金，用SEM(Mira3 Xmh，TESCAN)在5.0 kV電壓下觀察其形貌.

1.5 真皮支架材料的細胞黏附實驗

細胞黏附實驗的具體過程是:

1)分別取真皮支架試樣上中下3組分4份鋪于培養皿中，75%酒精浸泡過夜，用PBS洗滌3次，將材料放于鋪有1%瓊脂糖的24孔板中.

2)將35 μ L ROS1728大鼠成骨細胞懸液滴加至試樣表面，含5×104個細胞，細胞代數為第21代，培養3 h后每孔加入1 mL培養液，培養3 d后將試樣移至新孔 ，用PBS 洗 3次.取 10 μ L Calcein-AM 儲備液和15 μ L PI儲備液至5 mL PBS中配成熒光染液，利用Calcein-AM和PI分別對活細胞和死細胞染色.每份材料加入1mL染色液，37℃孵育15min.吸去染色液，用PBS洗3次.進行熒光觀察.綠色熒光為活細胞，紅色熒光為死細胞.

2 結 果

2.1 真皮支架形貌結構

真皮支架上中下3組分的SEM形貌圖如圖1所示.

圖1 真皮支架上中下3組分的SEM形貌圖

從圖1可以明顯看出，真皮支架的中層結構孔徑比上下層都大一些，結構比較疏松，成孔成絲的結構占大部分，而上下層支架結構比較成片狀.同時，從上中下3層結構的100倍SEM圖可以看出，從上到下層支架結構越發交織錯亂，說明離心力使得支架結構交聯，進而得到致密的結構.

2.2 真皮支架孔徑分析

真皮支架孔徑分布如圖2所示.

圖2 真皮支架結構上中下3層孔徑分布

從圖2可看出，在離心力作用下所得到的真皮支架的中層結構孔徑最大，而底層結構相對比較致密，同時中間層的孔徑分布較為狹窄.

2.3 真皮支架結構孔隙率分析

真皮支架結構孔隙率和容重如圖3與圖4所示.

圖3 浸泡不同時間段后的真皮支架3層的孔隙率

圖4 浸泡不同時間段后的真皮支架3層的容重

由圖3可看出，在膠原質量分數不變的情況下，離心力使膠原真皮支架產生孔徑梯度，使得支架材料中部顯孔隙率相對較小，而底部的顯孔隙率相對較大.而從圖4可看出，真皮支架容重從上層至下層呈增加趨勢，說明從上到下支架層壁的厚度呈增加趨勢.同時，支架材料浸泡在不同時間段后所呈現的規律基本不變，說明在實驗過程中，浸泡時間對支架材料結構的孔隙率和容重沒有直接影響.

2.4 細胞粘附實驗

成纖維細胞在真皮支架上中下3層結構上培養72 h后的熒光染色圖如圖5所示.

圖5 真皮支架結構上中下3層上成纖維細胞黏附生長情況熒光圖

從圖5可看出，A、B、C圖中都可以看到材料表面有綠色的熒光，這些是存活的細胞，表明材料能促進細胞黏附生長，細胞相容性良好，上中下3層的細胞密度沒有明顯差異，說明該梯度結構支架各層均適宜細胞的黏附生長.

3 結 語

采用離心—冷凍法結合冷凍干燥法所制得的真皮支架，由于制備過程中離心力的影響，支架上中下3層呈現出不同的三維結構，具體表現在孔徑上:上層孔徑 ，52 ±27.8 μ m ，中層孔徑 ，57 ±8.7 μ m ，下層孔徑 ，49±40.4 μ m ，其中 ，下層結構相對致密，同時孔徑較小，但孔徑分布較為分散；而中層最為用孔壁的分析結果，孔徑大，但孔徑大小較為集中.支架細胞黏附實驗表明，支架各層結構均利于細胞的粘附生長.本研究證實了真皮支架在制備過程中離心力產生了梯度孔結構，但支架各層的生物相容性未產生顯著差異，均有良好的生物相容性.研究也證實，離心—冷凍法結合冷凍干燥法是一種制備梯度孔徑結構材料的一種有效方法.

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Dermis Scaffold of Gradient Pore Structure Fabricated by Centrifugal-freeze Method

WANGMingbo1，WANGJun1，TAN Rongwei2，SHE Zhending1

(1.Key Laboratory for Biological Medical Material and Implantable Device，Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shenzhen 518057，China；2.Shenzhen Lando Biological Material Limited Company，Shenzhen 518057，China)

There are many factors controlling the microstructure and properties of collagen-based dermis scaffold，such as other main materials，the pore diameter and porosity aswell as the cross-linking density.Dermis scaffold of gradient pore structure was fabricated by combination of centrifugal-freeze method and freeze-drying method.The pore diameter and porosity of the scaffoldwere investigated by scanning electron microscope.Biocompatibility and cell adhesion properties of the scaffold were tested by experiment of cell culture growth to characterize the influence of centrifugal force.The results show that the centrifugal force has important influence on the microstructure of dermis scaffold with different degree of densification from the bottom up on the three layers and the pore diameters are different from each other，like the upper is 52±27.8 μ m ，the middle is 57 ±8.7 μ m and the lower is 49 ±40.4 μ m.Moreover，the results of cell adhesion experiment show that the lower layer is more suitable for the adhesion and growth of cell among the three different structures.

dermis scaffold；centrifugal force；biocompatibility

R318.08

A

1004-5422(2012)04-0305-04

2012-09-28.

廣東省教育部產學研結合項目(2010B090400324)，深圳市生物、互聯網、新能源產業發展專項基金(CSB2010C5260047A)資助項目.

王明波(1976—)，男，博士，副主任研究員，從事生物活性因子及藥物緩釋與相關材料研究.