泡核桃殼提取物體外抗菌實驗的初步研究

張海珠，馬 媛，周 萍

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

泡核桃（Juglans sigillata）又名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，系胡桃科（ Juglandaceae）胡桃屬（ Juglans）植物。種植較廣泛，主要分布于云南〔1〕、貴州、四川西部等，生長于海拔1300～3300 m山坡或山谷林中〔2〕。核桃取仁后的副產物即為核桃殼，其質地堅硬，常被作為廢物棄掉或焚燒，造成了資源的極大浪費，其利用價值極低。為使這一生物資源得到有效利用，學者們從多方面對它的應用價值進行研究，取得了一定成果，如制造活性炭〔3-5〕、作為新能源燃料〔6〕、制造眼鏡、手表等零件的清洗和拋光材料〔7〕、作為濾料、堵漏材料、有機稀釋肥、抗聚劑〔8〕、催化熱解制取氫氣〔9〕、制備木材膠粘劑〔10〕、制造顆粒填充聚氯乙烯基復合材料可改善材料的隔聲性能〔11〕等應用。并發現核桃殼具有一定的藥理作用，如提取物對心肌缺血有保護作用〔12〕、木醋液有抑菌作用〔13〕等。本實驗對核桃殼的提取物HTKD、HTKE、HTKF對常見致病菌的抑制作用進行了初步實驗，并測定了它們的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以期進一步開發核桃殼的藥用價值，拓展其應用前景。

1 實驗儀器與試藥

1.1 實驗儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），電熱恒溫培養箱（蕭山永發電器有限公司滬南實驗儀器廠），隔水式恒溫培養箱（上海-恒科技有限公司、上海-恒科學儀器有限公司），SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 實驗試藥 MH（A）培養基、MH（B）、沙氏瓊脂培養基、液體沙氏瓊脂培養基、瓊脂粉等均由北京奧博星生物技術有限責任公司提供。綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌均由大理學院基礎醫學院病原微生物教研室提供。泡核桃采集自云南省大理州漾濞縣，由大理學院生藥學教研室周濃副教授鑒定為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物泡核桃（ Juglans sigillata）。

2 實驗方法

2.1 泡核桃提取物原液的配制 泡核桃殼經10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調pH為中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD、HTKE、HTKF提取物。精密稱取HTKD、HTKE、HTKF組分，用蒸餾水溶解，配制成濃度為250 mg/mL、333.3 mg/mL、200 mg/mL的藥物原液，滅菌后備用。

2.2 供試菌混懸液的制備 將6種細菌菌落（遵循少量多次的原則）置于約2 mL生理鹽水中，混勻，與0.5麥氏比濁管比對，相同后用液體肉湯/沙氏培養基稀釋3次，使含菌量約為0.5×106CFU/mL，作為供試菌混懸液。

2.3 核桃殼提取物MIC和MBC的測定〔14〕

2.3.1 MIC的測定 將三種組分藥物原液用試管稀釋法進行倍比稀釋為10管，過濾后，按濃度從低到高的順序依次吸取100 μL加入到96孔板的相應孔中，再向此些孔中加入100 μL菌液（濃度為0.5×106CFU/mL），置37 ℃恒溫培養箱中培養24 h〔15〕。 板中可用肉眼觀察到有渾濁的孔表示有細菌生長，每行最后一個澄清的孔中的藥物稀釋濃度即為該藥物的MIC。

2.3.2 MBC的測定 取MIC測定中無細菌生長孔中的混合液各100 μL注入瓊脂培養基，用涂布法展開，放入37℃恒溫培養箱培養24 h，以菌落數不超過5個的平板所對應的小試管的最低藥物濃度為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

2.4 對照實驗 空白對照：200 μL液體培養基，藥液和菌液均不加；陰性對照：液體培養基100 μL加稀釋后最小濃度的藥液100 μL，不加菌液；陽性對照：液體培養基100 μL，加相應的菌液100 μL，不加藥液。

3 結果

3.1 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的抗菌實驗結果 （ 表1～3）

表1 核桃殼HTKD組分的抗菌實驗結果

表2 核桃殼HTKE組分的抗菌實驗結果

表3 核桃殼HTKF組分的抗菌實驗結果

3.2 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的MIC及MBC （表4～5）

表4 核桃殼提取物對8種細菌的MIC

表5 核桃殼提取物對8種細菌的MBC

4 討論

本實驗采用微量稀釋法進行泡核桃殼提取物HTKD、HTKE、HTKF組分進行MIC、MBC的測定，對了解泡核桃殼提取物有無抗菌作用、抗菌效果如何、確定用藥劑量和研究抗菌機理等方面具有重要意義。實驗結果表明泡核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分對綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌等8種臨床常見致病菌均有一定的抑制或殺滅作用。雖然此實驗呈現了一定的結果，但是體外抗菌實驗的環境與體內不同，所以這些提取物還需要進一步通過動物體內實驗來證明其抗菌作用，進而為開發核桃殼的抗菌藥用價值奠定基礎。

近年來，不合理使用抗生素導致耐藥菌逐漸增多，這些細菌的感染嚴重威脅人類的健康。但細菌較少對抗菌中藥產生耐藥，研究和開發抗菌中藥對解決耐藥細菌的產生具有重要意義〔16〕。本實驗研究的泡核桃殼具有來源廣泛、費用低等優點，對其進行抗菌成分及機理的研究，通過建立動物模型，設定客觀的評價標準，為其今后在臨床應用提供科學依據。

〔1〕黃俊杰，柏斌.大理核桃基地面積達35萬公頃〔J〕.中國果業信息，2009，26（ 8）：48.

〔2〕中國科學院中國植物志編委會.中國植物志〔M〕.1版.北京：科學出版社，1979：31-32.

〔3〕汪文祥，公偉偉，高朋召.源于核桃殼的生物形態多孔炭的制備及其性能研究〔J〕.陶瓷學報，2010，31（ 3）：463-467.

〔4〕信欣，何歆，崔鈳，等.核桃殼炭化吸附廢水中Cr（Ⅵ）的性能研究〔J〕.環境工程學報，2010，4（ 10）：2273-2277.

〔5〕李秀玲，趙朝成.核桃殼質活性炭的制備及吸附惡臭氣體的研究〔J〕.環境科技，2009，22（ 6）：32-34.

〔6〕金曼.低碳經濟背景下山核桃殼炭的推廣利用〔J〕.科技創新導報，2010，36：72.

〔7〕馬玉蘭.淺論核桃的使用價值〔J〕.青海農牧業，2007，1（ 89）：36.

〔8〕張利波，彭金輝，范興祥，等.核桃殼綜合利用技術的現狀〔J〕.化工通訊，2003，37（ 2）：21-25.

〔9〕張蕾，張磊，舒新前，等.核桃殼催化熱解制取氫氣〔J〕.吉林大學學報：工學版，2008，38（ 2）：287-291.

〔10〕鄭志峰，鄒局春，劉本安，等.核桃殼液化產物制備木材膠粘劑的研究〔J〕.中山大學學報，2007，28（ 4）：1-3.

〔11〕俞未明，朱春燕，高磊，等.核桃殼顆粒填充聚氯乙烯基復合材料的隔聲性能〔J〕.浙江理工大學學報，2008，25（ 5）：497-501.

〔12〕王維亭，趙專友，周則衛，等.核桃殼提取物對大鼠急性心肌缺血作用的影響〔J〕.中國醫院藥學雜志，2010，30（ 5）：386-388.

〔13〕尉芹，馬希漢，鄭滔.核桃殼木醋液的制取、成分分析及抑菌試驗〔J〕.農業工程學報，2008，24（ 7）：276-279.

〔14〕徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2001：1658.

〔15〕范青生，馬振亞.防腐抑菌中藥的微量快速篩選法研究及其應用〔J〕.微生物學通報，1991，18（ 2）：114-117.

〔16〕喬海霞，甄攀，李秀娟，等.吳茱萸提取物體外抗菌作用初步研究〔J〕.河北北方學院學報，2009，26（ 1）：27-29.