RP-HPLC法測定桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量

李勝囡，韓本序，劉圣旭，肖培云

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

桑姜感冒膠囊是常用的中成藥制劑，由桑葉、菊花、紫蘇、連翹、苦杏仁、干姜等中藥提取加工制成，具有散風清熱，祛寒止咳等功效，用于感冒、咳嗽、頭痛、咽喉腫痛〔1〕。綠原酸為桑姜感冒膠囊配方中的桑葉、菊花、連翹三味藥材的主要活性成分之一〔2〕，但現(xiàn)行質(zhì)量標準中并未對其含量進行控制，本文建立了反相高效液相色譜法測定綠原酸的含量，能有效控制該藥品的質(zhì)量。所建立的方法操作簡便、結果準確、重復性好，適用于桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Agilent 1200高效液相色譜儀；SK3200LH超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；AL204-IC電子分析天平（ Mettler Toledo）。

1.2 試藥 綠原酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-200413），桑姜感冒膠囊（ 四川好醫(yī)生藥業(yè)集團有限公司，批號110148、110127、110116）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（ 9∶91）〔3-4〕；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm〔5-8〕；進樣量：10 μL，綠原酸與相鄰峰達到基線分離，理論板數(shù)按綠原酸峰計不低于5000。HPLC色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品10 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，溶解，定容，搖勻，即得濃度為1.0 mg/mL的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

圖1 桑姜感冒膠囊HPLC色譜圖

2.3 供試品溶液的制備 取膠囊10粒，取出內(nèi)容物，稱重，計算平均粒重。精密稱取供試品內(nèi)容物約1.0 g，置100 mL圓底燒瓶中，加60%甲醇25 mL，稱重，超聲處理（ 功率：500 W，頻率：40 kHz）40 min，補重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 陰性對照液的制備 按處方比例，制備除桑葉、菊花、連翹外的陰性樣品〔9-10〕，按“ 2.3”項下方法制備陰性對照溶液，依法測定，結果表明陰性對照液無干擾，見圖1。

2.5 提取溶劑濃度的考察 精密稱取樣品7份，每份約1.0 g，分別加40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%甲醇25 mL，超聲提取40 min，補重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液進樣10 μL，測定綠原酸的峰面積，并計算綠原酸的平均含量。得提取溶劑濃度與峰面積的關系如圖2，故選擇60%的甲醇作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑濃度與峰面積的關系

2.6 提取時間考察 精密稱取樣品6份，每份約1.0 g，加60%的甲醇25 mL，分別超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）10、20、30、40、50、60 min，按“ 2.1”項色譜條件進行測定，測定綠原酸的峰面積，并計算綠原酸的平均含量，結果表明超聲40 min即可將樣品中的綠原酸提取完全。因此，選擇提取時間為40 min。 見圖3。

圖3 提取時間與峰面積的關系

2.7 線性關系的考察 精密吸取0.1 mg/mL對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，依次進樣，以峰面積為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=9.0×10-4C-0.2095，r=0.9998， 結果表明綠原酸進樣量在0.02～0.25 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.8 精密度試驗 取對照品溶液按“2.1”項色譜條件，每次進樣10 μL，重復進樣6次，測定峰面積，結果峰面積平均值為2349.55，RSD為0.70%（ n=6），表明進樣精密度良好。

2.9 重復性試驗 精密稱取同一批號（110148）樣品5份，按“ 2.3”項處理，按照“ 2.1”項色譜條件測定峰面積，結果供試品中綠原酸的平均含量為1.62 mg/g，RSD為1.60%，結果表明本實驗重復性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項制備供試品溶液，分別在2、4、8、12、24 h進樣10 μL， 測得綠原酸的RSD為1.30%（n=5），表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.11 加樣回收率試驗 取本品（批號110148，含量1.62 mg/g）10粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱取約0.5 g，共6份，按表1精密加入綠原酸對照品溶液，按“2.3”項步驟操作，按照“2.1”項色譜條件測定峰面積，計算回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.12 樣品的測定 取3個不同批號的供試品，按“2.3”項步驟操作，并按“2.1”項色譜條件測定，進樣10 μL，測定峰面積，按外標法計算綠原酸的含量，結果3批樣品中綠原酸的含量分別為1.57、1.57、1.39 mg/g。

3 討論

在流動相的選擇過程中，試驗比較了乙腈與水、乙腈與0.2%磷酸、乙腈與0.4%磷酸的多種不同配比，結果流動相為乙腈：0.4%磷酸（9∶91）出峰時間適當，綠原酸與鄰峰能達到較好的線分離，峰的對稱性好，故選擇乙腈0.4%磷酸（9∶91）為該試驗的流動相。

文獻報道，綠原酸對熱不穩(wěn)定，溫度太高綠原酸發(fā)生離解，溫度太低不利于綠原酸的溶出，故選擇50℃作為提取溫度。

曾考察分別用甲醇和乙醇作為提取溶劑，但結果表明在相同提取時間內(nèi)甲醇的提取效率更高，這可能與甲醇的分子小，對植物細胞的穿透作用強，活性成分的溶出率高有關，故本試驗采用甲醇作為提取溶劑。

采用RP-HPLC法測定桑姜感冒膠囊中綠原酸的含量，操作簡便、方法可靠、結果準確、靈敏度高、重復性好，進一步提高、完善了原質(zhì)量標準。

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