血管內皮生長因子-C/VEGFR-3在宮頸癌及上皮內瘤樣變中的表達

陳志琴 陳海燕 林美姜 劉佳華

浸潤性宮頸癌(invasive carcinoma of cervix，ICC)為常見婦科惡性腫瘤[1]。世界范圍內，其發病率在女性腫瘤中排第2位，呈升高和低齡化趨勢。宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是與ICC密切相關的一組癌前病變，早期診斷和治療CIN可降低宮頸癌的發病率及病死率，對提高患者的生活質量有著極其重要的意義。血管內皮生長因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)C與淋巴管內皮細胞表面受體VEGFR-3結合，介導淋巴管內皮細胞的趨化增殖、分化和淋巴管的增生，是迄今公認的淋巴管生成因子。本研究采用免疫組化方法測定VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC病例中表達情況，探討VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC中的表達變化情況，闡明宮頸癌發生發展過程中，淋巴血管形成的表型可能發生的時期。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年9月～2011年7月福建醫科大學省立臨床醫學院婦產科門診及住院患者為研究對象。年齡21～63歲，中位年齡36歲。分為4組：CIN I組，共33例；CINⅡ組，共32例；CIN III組，共37例；ICC組，共30例，其中9例盆腔淋巴結轉移。各組術前均未行放療、化療，半年內未經過激素治療。兔抗人VEGF-C多克隆抗體及兔抗人VEGFR-3多克隆抗體工作液、SP免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 免疫組化方法 將經中性福爾馬林固定、石蠟包埋的宮頸病變標本連續切片2張，采用SP免疫組化染色，使用微波爐抗原熱修復，抗原修復液為pH 6.0的檸檬酸緩沖液，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，經DAB顯色，蘇木精對比染色后，中性樹膠封片。用已知陽性片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定

1.3.1 VEGF-C VEGF-C的陽性物質為棕黃色細顆粒狀，主要位于細胞質內。高倍鏡下隨機取5個視野(每視野細胞數不少于200個)，按陽性細胞所占百分比及著色程度進行結果判定。按陽性細胞比例判定：陽性細胞≤10%1分，10%～50%2分，>50%3分；按染色程度判定：陰性為0分；淡黃色為1分；中度黃色為2分，棕黃色為3分。按陽性細胞得分×染色程度得分計總分，總分<3為陰性，≥3為陽性。

1.3.2 VEGFR-3 VEGFR-3陽性為淋巴管內皮細胞胞質內出現棕黃色顆粒。VEGFR-3脈管判斷標準及計數方法：低倍鏡下尋找VEGFR-3陽性脈管密集區，即熱區，100倍視野計數5個熱區中VEGFR-3陽性脈管數，取平均值。

1.4 統計學方法 使用SPSS11.0軟件對所得數據進行統計學處理，采用χ2檢驗與秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

VEGF-C在CIN I、CIN Ⅱ組、CIN III組以及ICC組中的陽性率分別為6.06%、9.38%、83.78%以及86.67%。VEGFR-3在CIN I組、CIN Ⅱ組、CIN III組以及ICC組中的陽性率分別為9.09%、9.38%、81.08%以及90.00%，見表1。

表1 4組VEGF-C/VEGFR-3的陽性表達情況

ICC組VEGF-C、VEGFR-3陽性率明顯高于CIN I組和CIN II組，差異有統計學意義(均P<0.05)，而與CIN III組相比差異無統計學意義(P>0.05)；CIN III組與CIN I組和CIN II組相比差異均有統計學意義(均P<0.05)；CIN I組與CIN II組相比差異無統計學意義(P>0.05)。另外，7例演進為ICC的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強陽性表達，有5例發生盆腔淋巴結轉移；在ICC組26例VEGF-C陽性表達的患者中，有9例發現盆腔淋巴結轉移，而4例陰性表達者中，無一例發生盆腔淋巴結轉移。

3 討論

宮頸癌的轉移途徑主要是直接蔓延和淋巴結轉移，腫瘤是否已播散到區域淋巴結對患者的預后產生極大影響，臨床多以有無淋巴結轉移來評估預后及指導治療，Ho等[2]回顧性分析197例早期宮頸癌，根據其術后病理分3組，低危組：局限于子宮，無脈管累及；中危組，盆腔淋巴結轉移不伴脈管累及，或脈管累及伴間質淺層受侵；高危組：脈管累及合并深間質浸潤，或髂總或腹主動脈旁淋巴轉移，上述3組的5年無瘤生存率分別為89%、69%和43%，認為淋巴結轉移、脈管累及和深間質浸潤是影響宮頸癌預后的3大高危病理因素。因此早期預測和發現有無淋巴結轉移具有重要臨床意義。緣于VEGF家族的新成員VEGF-C被發現和研究之后，目前已逐漸成為腫瘤研究的熱點之一。

VEGF-C是VEGF家族中的一個新成員，是淋巴管生成因子，可激活位于淋巴管內皮細胞上的VEGFR-3參與腫瘤內和瘤旁淋巴管的生成，與多種腫瘤的區域淋巴結轉移密切相關。目前認為，VEGF-C通過結合并激活VEGFR-3改變淋巴屏障作用[3]，導致淋巴管增生，對胚胎發育和腫瘤的生長和轉移起重要調控作用。Yonemura等[4]利用TR-PCR和免疫組化研究85例胃癌中VEGF-C/VEGFR-3的表達，發現在胃癌組織中，VEGF-C/VEGFR-3的表達之間在統計學上具有正相關。VEGFR-3主要在淋巴管內皮細胞中表達，VEGF-C主要在原發腫瘤中表達。VEGF-C的表達和淋巴結狀況、淋巴的浸潤、靜脈的侵襲、腫瘤浸潤之間有一個強的相關。Fujimoto等[5]研究40例淋巴結轉移的宮頸癌患者，24例VEGF-C顯著升高，淋巴結轉移且VEGF-C升高者，24個月生存率為38%，無VEGF-C升高的淋巴結轉移者24個月生存率81%，認為宮頸癌中VEGF-C高表達，促進腫瘤經淋巴道轉移，是判斷預后的指標。Van Trappen等[6]研究VEGF-C及其受體VEGFR-3在103例CIN(CIN I，II和III分別為33，33和37例)和49例宮頸鱗癌中的表達情況，免疫組化結果顯示，VEGF-C和VEGFR-3的蛋白表達在宮頸癌形成的不同分期差異有統計學意義，CIN I，II和III之間差異有統計學意義(P<0.05)，而CIN III和宮頸癌之間卻無明顯差異。超過50%的CIN III和宮頸癌中顯示VEGF-C和VEGFR-3中度至強陽性染色，而CIN I和II中僅有15%顯示陽性表達。9例演進為宮頸癌的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強陽性表達。這些結果表明，在宮頸癌發生發展過程中，淋巴血管形成的表型可能發生在CIN III期。

本研究結果顯示，CIN I、CIN II組織中幾乎不表達VEGF-C/VEGFR-3，而CIN III和ICC組織中VEGF-C/VEGFR-3陽性表達率明顯升高，7例演進為ICC的CIN III顯示VEGF-C/VEGFR-3呈強陽性表達，有5例發生盆腔淋巴結轉移；在ICC組26例VEGF-C陽性表達的患者中，有9例發現盆腔淋巴結轉移，而4例陰性表達者中，無一例發生盆腔淋巴結轉移。

綜上所述，在宮頸癌發生發展過程中，淋巴血管形成的表型可能發生在CIN III期。深刻認識VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC淋巴轉移中的作用，為CIN和ICC的治療開拓了新的視野，提供新的研究方向。隨著檢測手段的不斷進步和CIN轉歸機制的深入研究，盡早對CIN實行干預，可以降低ICC的發病率和病死率。

[1]周晨.56例35歲以下浸潤性宮頸癌患者預后因素分析[J].當代醫學，2010，16（34）：40-42.

[2]Ho CM,Chien TY,Huang SH,et al.Multivariate analysis of the prognostic factors and outcomes in early cervical cancer patients undergoing radical hysterectomy[J].Gynecol Oncol,2004,93(2):458-464.

[3]Breslin JW,Yuan SY, Wu MH.VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells though a VEGFR-3-dependent mechanism[J].Lymphat Res Biol,2007,5(2)：105-l13.

[4]Yonemura Y,Fushida S,Bando E,et a1.Lymphangiogenesis and the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-3 in gastric cancer[J].EurJ Cancer,2001,37(7):9l8-923.

[5]Fujimoto J,Toyoki H,Sato E,et al.Clinical implication of expression of vascular endothelial growth factor-C in metastatic lymph nodes of uterine cervical cancers[J].Br J Cancer,2004,91(3):466-469.

[6]Van Trappen PO,Steele D,Lowe DG,et a1.Expression of vascular endothe1ial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D,and their receptor VEGFR-3,during different stages of cervical carcinogenesis[J].J Pathol,2003,201(4):544-554.