乳腺癌人表皮生長因子受體-2基因擴增的意義

薛霜 趙躍武 許梅 宋曉霞 崔改華 孔令非

近來，乳腺癌成為女性最常見的惡性腫瘤之一，治療多采用手術、化療、放療、內分泌治療及靶向藥物治療等為主的綜合治療[1]。人表皮生長因子受體-2(HER2)在乳腺癌患者的高水平表達對臨床治療方案的選擇有指導作用，尤其是針對單克隆抗體赫塞汀（Herceptin）的臨床應用,而雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達是應用內分泌藥物治療不可或缺的重要依據，因此，我們應用免疫組織化學方法檢測乳腺癌手術標本中HER2、ER和PR的表達情況，分析它們與臨床病理特征的關系，并用FISH檢測乳腺癌手術標本中HER2基因擴增狀態，比較IHC檢測與FISH 檢測的一致性程度，為臨床治療選擇用藥提供相關依據。

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1 資料與方法

1.1 臨床資料 95例乳腺癌標本來自河南省人民醫院2010年1～12月間手術切除的標本蠟塊。患者年齡25～80歲，平均（51.2±6.1）歲，有腋窩淋巴結轉移者50例。兔抗人單克隆抗體ER、PR、HER2及Max Vision TM試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司。HER2基因擴增檢測試劑盒購自北京金菩嘉醫療科技有限公司，熒光顯微鏡為日本Olympas(BX41）。

取同一供試品6份（0.1 g），分別精密稱定重量，按樣品測定方法依法測定含氮量。結果分別為：3.0071%、3.0343%、2.9642%、2.9861%、2.9617%、3.0116%，平均值為2.9942%，RSD為1.0%（n=6），精密度結果良好。見表2。

1.2 方法

本研究結果提示,應用利培酮對精神分裂進行治療,能有效改善患者精神癥狀,且不良反應輕,但可導致患者血脂異常及泌乳素水平上升。因此,在應用利培酮對精神分裂癥患者進行治療的過程中,需針對患者血脂和泌乳素實施定期的監測,加強相關危險因素方面的評估。

1.2.1 乳腺癌組織學分型及分級 按照WHO乳腺腫瘤組織學分類(2003)標準進行病理分型、分級［2］，其中浸潤性導管癌84例，浸潤性小葉癌11例。浸潤性導管癌分為3級，其中Ⅰ級18例，Ⅱ級56例，Ⅲ級21例。

1.2.3 免疫組織化學（IHC）采用Max VisionTM法，切片經脫蠟、3%H2O2封閉后，置入pH6.0檸檬酸緩沖液中高壓鍋熱修復，滴加一抗（室溫2h），滴加二抗（37℃，20min）DAB顯色、蘇木精對比染色、封固。

1.2.2 熒光原位雜交（FISH） 標本固定于10%中性甲醛中，24～48h后石蠟包埋，對照HE切片，選出浸潤癌實驗區切片厚3μm，65℃烤片2h，二甲苯脫蠟至無水乙醇→0.21mol/L HCL浸泡20min，去離子水洗3min→2×SSC緩沖液洗5min→50℃預熱的30%酸性亞硫酸鈉20min→去離子水洗2min，2×SSC洗5min→37℃蛋白酶K消化8～15min→2×SSC洗5min→切片45℃干燥2～5min→10%中性甲醛固定10min，2×SSC洗5min→78℃甲酰胺中變性5min→立即分別置入-20℃70%、85%、100%乙醇中2min，自然干燥。配制10μL探針，73℃水浴變性5min后置入46℃水浴中2～5min。滴加探針至組織切片上，蓋片后并封片膠封邊。置入40℃雜交濕盒過夜（14～18h）。將切片置洗滌液（2×SSC，0.1%NP40）洗去多余探針，室溫暗處干燥，加13μL DAPI顯色液對比染色。蓋玻片后熒光顯微鏡觀察結果。

2.2 HER2基因擴增與HER2蛋白表達關系 95例乳腺癌組織標本中，FISH檢測HER2基因擴增28例（29.5%），其中12例HER2(+++)中有12例HER2基因擴增（100%）；50例HER2(++)中有14例HER2基因擴增（28%）；21例HER2(+)中有2例HER2基因擴增（9.52%），其余均無擴增，HER2基因擴增在HER2表達強弱不同間差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

1.3.2 IHC結果判斷 HER2表達顯示細胞膜呈棕黃色，ER、PR表達顯示細胞核呈棕黃色。按照美國乳腺癌HER2檢測指南［3］標準，HER2陽性結果為+++（>30%浸潤癌細胞的細胞膜呈完整的強著色），不確定結果為++（至少10%腫瘤細胞有完整的細胞膜著色，但染色不均勻或強度較弱）。陰性結果為-或+（任何比例的腫瘤細胞有微弱的、不完整的細胞膜著色或無著色）。ER/PR陽性認定，強度：0為陰性，1為弱陽性，2為中等陽性，3為強陽性；陽性細胞百分比：0為陰性，1為陽性細胞＜1%，2為陽性細胞1%～10%，3為陽性細胞11%～33%，4為陽性細胞34%～66%，5為陽性細胞≥67%。兩項分數加起來≥3為陽性。

1.3.1 FISH結果判斷 試劑盒中混合了兩種DNA探針，一是標記為綠色熒光的17號染色體著絲粒，另一是標記為橙紅色熒光的HER2基因，細胞核由DAPI染成藍色。所檢標本中75%以上癌細胞核中都有雜交信號。計數時選擇DAPI染色均一，細胞核邊界完整，無重疊的細胞，隨機計數30個細胞，紅色信號的總數與綠色信號的總數比值大于2.2時，為HER2基因擴增，紅色信號為眾多信號連接成簇時可不用計算，即為基因擴增。若比值介于1.8～2.2，再增加計數細胞，比值小于1.8則無HER2基因擴增。17號染色體信號狀況，根據信號的數目分為單體、雙體和多體（著絲粒信號數＞2）。

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2.1 HER-2、ER、PR在乳腺癌組織中的表達 乳腺癌組織中HER-2、ER、PR表達率分別為87.4%、61.1%、54.7%，與不同年齡組、組織分級、病理類型、腋窩淋巴結是否轉移間表達差異均無統計學意義（P>0.05）；與腫瘤大小間的差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 HER2基因擴增與乳腺癌臨床病理參數的關系 84例浸潤性導管癌中有28例（33.3%）有HER2基因擴增，11例浸潤性小葉癌中無HER2基因擴增，HER2基因擴增在浸潤性乳腺癌病理類型間差異有統計學意義（P<0.05）；HER2基因擴增與ER和PR的IHC表達間的差異有統計學意義（P<0.05）；HER2基因擴增在浸潤性導管癌的組織學分級及有無腋窩淋巴結轉移間差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2 結果

1.4 統計學方法 采用R軟件（2.11.0版）的Pearsonχ2檢驗（Pearson's Chi-squared test），P<0.05為差異有統計學意義。

表1 HER-2、ER、PR表達與臨床病理特征的關系（例）

1.3 結果判定

根據三維模型分析結果，在變壓器本體抽真空期間，等效于在箱壁內側時間-101Kpa的載荷，在假定箱壁邊沿不發生位移的情況下，套管底座箱蓋所受應力最大值為116.77Mpa，其最大變形量可達到1.6403mm；即在變壓器抽真空期間，油箱頂部的鋼板會向變壓器油箱內側方向最大產生1.6403mm的形變量(在套管安裝固定的圓周范圍內，由于現場條件可能產生不同的形變量，最大形變量計算為1.6403mm)。

表2 FISH檢測HER2與臨床病理參數的關系

3 討論

HER2屬于酪氨酸激酶受體家族成員，是人類原癌基因。研究表明，在乳腺癌患者中，有25%～30%的患者會有HER-2蛋白的表達，而這其中有90%～95%HER2基因擴增[4]。1998年美國FDA認證了第一個治療乳腺癌的分子靶向藥物赫賽汀，基于HER2在乳腺癌診斷及治療中重要的指導意義，采用最準確、合理的方法來檢測HER2表達狀態就尤為重要了。IHC和FISH為目前經美國FDA批準并且在臨床上廣泛應用檢測HER2的兩種方法，IHC是檢測HER2受體蛋白表達的情況，而FISH是檢測HER2基因的擴增情況。

本研究比較河南省乳腺癌患者IHC和FISH檢測HER2狀態的一致性。研究結果顯示，兩種方法統計學上差異無統計學意義，但是IHC檢測HER2蛋白表達狀態不同時，兩者一致性有差別：對于IHC檢測HER2蛋白（+++），FISH陽性率為100%，（+～++）的患者FISH陽性率僅為9.52%和28%，而（-）表達的患者陽性率為0，這顯示了IHC結果為（+++）的患者，兩種檢測方法一致性較高，可以直接作為診斷的依據。

HER2基因擴增在乳腺癌組織學類型間有明顯差別，84例浸潤性導管癌中HER2基因擴增28例（33.3%），11例浸潤性小葉癌中無HER2基因擴增；IHC檢測浸潤性導管癌中HER2蛋白陽性表達75例（89.3%），浸潤性小葉癌中HER2蛋白陽性表達8例（72.7%），說明IHC檢測HER2蛋白陽性狀態與乳腺癌病理類型無相關性[5]。這兩種檢測結果有差別，可能與檢測方法的準確程度以及IHC判讀標準的差別有關。本研究結果中HER2基因擴增率在乳腺癌患者組織學分級I、II、III中的表達率分別為22.2%、35.7%、19.1%，差異無統計學意義[6]，分析可能與我們所選病例中組織學分級II級浸潤性癌所占比例高有關系。

本研究結果發現，ER、PR蛋白均陰性表達時，HER2基因擴增率較高，提示ER、PR和HER2信號轉導通路上存在某些關聯，當ER表達降低時HER2表達增強[7]，從而抑制了內分泌的調節。

綜上所述，免疫組化檢測可作為HER2表達狀態的初篩，對于IHC檢測為（++）的患者，可以重點的進行FISH的檢測，對于（-）和（+）的患者，可以選擇性地進行FISH檢測，指導乳腺癌的分子靶向治療。

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[6]Tsuda H,Hirohashi S,Shimosato Y,et al.Correlation between histologic grade of malignancy and copy number of c-erbB-2 gene in breast carcinoma.A retrospective analysis of 176 cases[J].Cancer,1990,65(8):1794-1800.

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