長(zhǎng)期飲酒后肺損傷大鼠Src抑制的蛋白激酶C底物的變化

劉義德 劉志

ALI/ARDS的主要病理特征是由于肺微血管通透性增高，肺泡滲出富含蛋白質(zhì)的液體導(dǎo)致肺水腫，進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重低氧血癥。蛋白激酶C（PKC）已被證明在急性肺損傷中可被激活，作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的骨架蛋白，引起內(nèi)皮回縮，細(xì)胞間隙增大，是引起血管通透性增加的一條重要途徑[1]。Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞支架蛋白，其相對(duì)分子量是280/290kDa，它不僅是PKC的結(jié)合底物，而且還是PKC和蛋白激酶A(PKA)的錨定蛋白，是PKC/ PKA的信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)SSeCKS是一種炎癥反應(yīng)蛋白，參與炎癥所致的肺組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其表達(dá)與炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒是ARDS發(fā)病的危險(xiǎn)因子，其機(jī)制之一是促使炎性因子釋放，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。長(zhǎng)期飲酒是否引起肺組織SSeCKS的表達(dá)改變，目前未見報(bào)道，我們通過建立長(zhǎng)期飲酒后內(nèi)、外源性肺損傷動(dòng)物模型來(lái)觀察SSeCKS在長(zhǎng)期飲酒后肺組織的表達(dá)變化及在不同病因?qū)е碌姆螕p傷時(shí)是否存在表達(dá)差異，為臨床治療急性肺損傷提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 動(dòng)物分組及模型制備：雄性SD大鼠36只，體重210g～250g（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，日照時(shí)間為12小時(shí)光照，分6籠飼養(yǎng)，每籠6只。

1.1.2 長(zhǎng)期飲酒模型建立：將大鼠隨機(jī)分為飲水組和飲酒組，每組18只，按照文獻(xiàn)建立長(zhǎng)期飲酒模型方法[3]，先適應(yīng)喂養(yǎng)3天，然后予以6%酒精替代飲水給飲酒組大鼠飲用3天，再換成10%酒精飲用4天，以后予以20%酒精連續(xù)飲用5周。飲水組自由飲水，兩組飼料均為清潔級(jí)全營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料。

1.1.3 肺內(nèi)外源性肺損傷模型建立：6周后，將飲水組和飲酒組大鼠各隨機(jī)分成3組，分別是單純飲水組6只、飲水內(nèi)源性肺損傷組6只、飲水外源性肺損傷組6只，單純性飲酒組6只，飲酒內(nèi)源性肺損傷組6只、飲酒外源性肺損傷組6只。內(nèi)源性肺損傷組大鼠經(jīng)稱重后予以1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)頸正中切口分離氣管，用7號(hào)針頭刺入氣管緩慢滴入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（15mg/kg）；外源性肺損傷大鼠予以LPS（15mg/kg）腹腔注射。

1.1.4 標(biāo)本采集 給藥4小時(shí)后，1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，放血處死大鼠，打開胸腔將雙肺完整取出，用冰鹽水仔細(xì)漂洗，清除上面的血跡，干紗布拭干，保存于-80℃冰箱待檢。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器和主要試劑 高速冷凍離心機(jī)（sigma公司），PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)，紫外分光光度計(jì)(UV-visible Spectrometer)，Triozol Reagent（Invitrogen公司），引物合成（北京華大基因公司），熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物公司），大腸桿菌脂多糖（LPS，sigma公司）。

1.2 操作步驟

1.2.1 Trizol法抽提總RNA。參照Trizol說(shuō)明書采取一步法提取總RNA。取0.1g肺組織置于1.5毫升離心管中加入Trizol 1ml，在冰浴中迅速勻漿15～30秒充分研碎組織，置于室溫中5分鐘，后加入0.2ml氯仿?lián)u振15秒，置室溫3分鐘，4℃離心，12000g×15min。吸取上清液0.5ml加入0.5ml異丙醇搖勻，-20℃置2小時(shí)，4℃離心12000g×15min。棄上清，加75%乙醇1ml，4℃離心，7500g×15min。棄上清，加Nuclease free water 15μl。采用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定260nm、280nm OD值，樣品-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA濃度和純度測(cè)定。取1μl RNA樣本，加79μl DEPC水，紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260與OD280，二者比值應(yīng)1.8～2.0，提示樣本中RNA純度合格。RNA(μg/μl)濃度＝OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將2μlRNA加入到逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，反應(yīng)體系為20μl，其中PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl、5×PrimeScript Buffer 4μl、Random 6 mers（100μM）1μl、Oligo dT Primer（50μM）1μl。Rnase Free dH2O 11μl。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成。用于PCR的大鼠SSeCKS和內(nèi)參GAPDH的引物均由北京華大基因公司合成。根據(jù)GenBank提供的SSeCKS基因序列（AY695056)設(shè)計(jì)上游引物為5’-AAGTGCTGGCTTCGGAGAAAG-3’(3106 3126)，下游引物為5’-TGACTTCAGGAACTT CAAGGCTC-3’(3215 3237)，內(nèi)參GAPDH 序列為上游引物5’-GCAAGTTCAACGGCACA-3’,下游引物5’-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3’。

1.2.5 PCR擴(kuò)增。 PCR按照說(shuō)明在ABI PRISM7500序列檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行，對(duì)cDNA樣本進(jìn)行雙份檢測(cè)以減小誤差。數(shù)據(jù)按2-△△CT法計(jì)算，結(jié)果以相對(duì)于GAPDH的倍數(shù)來(lái)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析，用最小顯著差法(1east significant difference，LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 飲水和飲酒各組肺組織SSeCKSmRNA表達(dá)變化

圖2 飲水各組肺組織SSeCKSmRNA表達(dá)變化

圖3 飲酒各組肺組織SSeCKSmRNA表達(dá)變化

2 結(jié)果

單純飲酒組肺組織SSeCKSmRNA表達(dá)較飲水組增多（P＜0.05），肺損傷各組肺組織SSeCKSmRNA表達(dá)較飲水組增多（P＜0.01），飲酒內(nèi)、外源性肺損傷各組較飲水內(nèi)、外源性肺損傷各組增多顯著（P＜0.05），飲酒內(nèi)、外源性肺損傷組之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1～3。

3 討論

SSeCKS是于1995年被Lin等在NIH3T3細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種PKC的底物，其氨基端內(nèi)豆蔻酰化，輔助其與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，二級(jí)結(jié)構(gòu)呈桿狀，富含丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸和谷氨酸基，是一種熱穩(wěn)定蛋白[4]。人與大鼠SSeCKS的DNA序列有高度的同源性。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒大鼠肺組織的SSeCKS表達(dá)較單純飲水大鼠有所增加。導(dǎo)致這一結(jié)果可能的機(jī)制為酒精的主要代謝產(chǎn)物乙醛可升高大鼠血清中AngⅡ的水平。當(dāng)AngⅡ作用于血管平滑肌細(xì)胞后，SSeCKSmRNA水平有明顯升高，并通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制參與了細(xì)胞支架和細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)，改變了血管的通透性[5]。增加了肺損傷的易感性。

SSeCKS是一種炎癥反應(yīng)蛋白，腹腔注射LPS后，可觀察到肺臟、心臟、肝臟、等組織的內(nèi)皮細(xì)胞SSeCKS mRNA表達(dá)增加，其中肺組織表達(dá)最為明顯[6]，研究表明SSeCKS在肺組織中定位于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVEC）[7]。PMVEC是炎癥反應(yīng)的重要反應(yīng)細(xì)胞。當(dāng)受到炎癥刺激時(shí)可激活PKC，作用于骨架蛋白，引起內(nèi)皮細(xì)胞的回縮，細(xì)胞間的粘附體變?nèi)酰踔料Фg隙增大，使血管通透性增加[8]。SSeCKS作為細(xì)胞支架蛋白，既是PKC的結(jié)合蛋白又是PKC作用的底物，在細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞分化和運(yùn)動(dòng)過程中起到很重要作用[9]。本實(shí)驗(yàn)顯示SSeCKSmRNA在損傷各組肺組織中表達(dá)均明顯增加，同其他研究結(jié)果相一致。飲酒損傷各組增加較飲水損傷各組更加顯著。提示長(zhǎng)期飲酒損傷組由于受到AngⅡ及LPS雙重刺激使SSeCKS表達(dá)進(jìn)一步增加。外源性肺損傷組SSeCKSmRA表達(dá)有高于內(nèi)源性肺損傷組趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于SSeCKS定位于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此，外源性肺損傷時(shí)其表達(dá)更為明顯。同時(shí)SSeCKS當(dāng)受到LPS誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)具有時(shí)間依賴性[10]，所以本實(shí)驗(yàn)內(nèi)、外源組表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能與所選取的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)，需進(jìn)一步深入研究。

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