灰飛虱體內Wolbachia的檢測及三種稻飛虱Wolbachia的wsp基因差異分析

許存賓， 劉 艷， 王錫鋒

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

Wolbachia是一類細胞內共生菌，是屬于α－變形菌門的立克次氏體。最早于1924年在尖音庫蚊（Culex pipiens Linnaeus）的生殖器官內發現，命名為 Wolbachia pipienti［1］。Wolbachia 普遍寄生于昆蟲、甲殼動物、螨蟲和絲狀線蟲類動物體內，據估計66%的昆蟲都感染有Wolbachia［2］。Wolbachia隨母系遺傳，參與調控寄主的誘導細胞質不親和（cyto－plasmic incompatibility，CI）、雄性致死（male－killing）、雌性化（feminization）、孤雌生殖（parthenogenesis inducing）等多種生殖活動［3－7］，從而有利于自身的生存與傳播，并影響寄主的生殖行為。此外也有研究表明Wolbachia能保護寄主抵御病原菌和寄生蟲等的侵害［8］。Wolbachia還能依靠寄主的捕食、寄生等行為在昆蟲的個體、群體間進行橫向傳播［9－10］。

早期的研究多用DAPI染色法和電鏡觀察昆蟲體內的 Wolbachia［11－12］。隨著分子生物學方法的快速發展，主要利用其16S／23SrDNA、groEL、ftsZ和wsp等基因進行PCR檢測與序列分析［13］。編碼表面蛋白的Wolbachia outer surface protein（wsp）基因是已知的Wolbachia基因中進化最快的基因，因而被廣泛地用于Wolbachia的PCR檢測與分子鑒別［14］。根據分子系統發生，Wolbachia的不同種屬被劃分為11個超群（supergroups A～K），節肢動物中的Wolbachia主要劃分在A和B超群，并在兩超群下又細分為12個組［14］。

水稻是我國最重要的糧食作物之一，水稻生產的豐歉直接影響我國的糧食安全。自20世紀60年代中期起，稻田3種飛虱（褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱）陸續成為影響我國水稻生產的重要生物災害。同時灰飛虱還可以在水稻、小麥、玉米上傳播水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒，引起的病毒病造成更為嚴重的損失［15］。長期以來國內外把研究重點放在與應急防治密切相關的技術研發上，而對與稻飛虱災變和持續治理相關的生物學和生態學基礎研究較少。特別是灰飛虱與內共生菌、病毒三者之間的相互關系的相關研究還未見報道。本研究的主要目的是檢測我國主要水稻產區灰飛虱攜帶的共生細菌Wolbachia比例，對其wsp基因進行序列測定與比較，為深入研究稻飛虱與其體內共生物的關系，揭示Wolbachia對共生昆蟲的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲源材料

本試驗所采用的灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallen）采集于我國12個省（自治區）21個水稻生產地區（見表1），采集時間為2010－2011年。田間活體采集并進行種類鑒定后，取部分樣品按采集地區隔離飼養，剩余樣品經液氮冷凍后－80℃冰箱保存備用。

1.2 DNA的提取

灰飛虱總DNA的提取采用Promega公司的Wizard Genomic DNA提取試劑盒，提取方法參考說明書略作改動。取冷凍保存單頭灰飛虱經乙醇消毒清洗后，切取腹部組織于1.5mL離心管，加入液氮后用玻璃研棒充分研磨并加入50μL核酸裂解液（nuclei lysis solution）勻漿，直至組織完全破裂，再用100μL核酸裂解液沖洗研棒，混勻后65℃溫浴20min。室溫冷卻，加入1μL RNase，37℃溫浴20min，加入80μL蛋白質沉淀劑（protein precipi－tation solution），振蕩混勻后冰浴5min，13 000～16 000r／min常溫離心6min。取上清于1.5mL離心管中，加入300mL常溫異丙醇，輕柔顛倒混勻，13 000～16 000r／min常溫離心3min，棄上清，加入75%乙醇，13 000～16 000r／min常溫離心2min，再加75%乙醇重復1次，超凈臺干燥后加入25μL ddH2O，65℃溫浴溶解1h，－20℃保存備用。

1.3 PCR擴增

參照Zhou等方法［14］進行Wolbachia的wsp基因的PCR擴增，采取通用引物 wsp－81F：5′－TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC－3′；wsp－691R：5′－AAA AAT TAA ACG CTA CTC A－3′，引物由華大基因公司合成。擴增反應液（25μL體系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴增程序進行：95℃預變性5min；95℃變性0.5min，55℃復性0.5min，72℃延伸1min，36次循環；最后在72℃延伸10min；4℃下保存備用。

根據灰飛虱線粒體基因序列（GenBank登錄號：FJ360695），設計引物COI－F：5′－ATT TAC CCA CCA CTA TCT－3′；COI－R：5′－TGG AAA TGA GCC ACT ACA－3′用于PCR擴增灰飛虱的COI基因，片段長度為752bp。擴增反應液（25μL體系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴增程序進行：94℃預變性3min；94℃變性1min，51℃復性0.5min；72℃延伸1min，36次循環；最后在72℃延伸10min，4℃下保存備用。

1.4 擴增產物的電泳檢測

取PCR特異性擴增產物5μL，在1%的瓊脂糖膠上進行電泳檢測（電壓100V，30min），紫外燈下觀察結果并保存，明確Wolbachia的wsp基因與灰飛虱的COI基因是否存在以及擴增片段的大小。

1.5 Wolbachia的wsp基因片段克隆和測序分析

PCR產物純化后，連接至pMD－18T載體上，轉化到DH 5α大腸桿菌感受態中。每個樣品選取3個陽性克隆由華大基因公司進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與PCR檢測

對采集自全國12個省份（自治區）21個地區共167頭灰飛虱樣品進行Wolbachia測定，以灰飛虱COI為對照。其中16個地區的灰飛虱都100%感染有Wolbachia，5個地區出現非陽性個體，四川遂寧地區感染率最低，平均陽性率為96.41%（見表1）。

表1 不同地區灰飛虱感染Wolbachia情況統計表

2.2 序列測定與分析

對167頭灰飛虱中的102頭的Wolbachia wsp進行了序列測定，獲得的wsp基因的序列長度均為599bp，各地理種群間序列僅存在極小的差異。21個地區群體中都具有相同的wsp序列個體，其中只有3個地區的個體中存在變異。云南大理（YNDL－1）樣品的46位存在突變T→C；四川郫縣（SCPX－2）樣品的231位存在突變A→G，云南保山（YNBS－6）樣品的584位存在一個gap。將全國大部分地區Wolbachia一樣的wsp序列命名為National－wsp，參照Zhou等［11］Wolbachia的分類，結合NCBI的blast工具，用MEGA v.5對上述序列進行聚類構建系統進化樹（圖1）。

圖1 灰飛虱體內Wolbachia的wsp基因的PCR產物電泳圖

從系統發育樹可以得出，灰飛虱體內Wolbachia在系統進化上屬于B超群（supergroup B）內Con組（Group Con）［14］。在地理區域上，國內各地區以及日本、泰國等地的灰飛虱Wolbachia處于同一分支，不存在地理種群的分化。

圖2 灰飛虱COI基因的PCR產物電泳圖

2.3 三種稻飛虱體內Wolbachia的wsp序列分析

利用NCBI數據庫，對比褐飛虱體內Wolbachia的wsp基因（GenBank登錄號：GU289775，FJ713754，FJ713760，GU289751）序列和白背飛虱體內Wolbachia的wsp基因（GenBank登錄號：GU361730，GU361731，GU361731，FJ713766）序列。其中白背飛虱與灰飛虱的序列完全一致，但兩者與褐飛虱存在較大差異，序列相似性只有83.39%。由此我們假設白背飛虱與灰飛虱可能感染有相同的Wolbachia（圖3所示，B超群下Con組），而褐飛虱可能感染另外一個株系的Wolbachia（圖3所示，B超群下Cau組）。系統進化樹中與灰飛虱和白背飛虱處于同一分支的還有寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）、寄生螯蜂（Dryinid wasp），與之相近的還有一種寄生絨繭蜂［Cotesia glomerata（L.）］，這些寄生昆蟲可能幫助了灰飛虱與白背飛虱體內Wolbachia在其種群內和種群間進行水平傳播。但是3種稻飛虱在自然界具有密切交匯，那么三者體內應該攜帶相似的Wolbachia，然而三者中兩者一樣而另一種存在差異。

圖3 灰飛虱體內Wolbachia與已報道的wsp基因構建系統發育樹

3 討論

通過設計Wolbachia的wsp基因的特異引物，對采集自我國12個省21個地區的灰飛虱進行鑒定，發現我國絕大部分地區灰飛虱都帶有Wolbachia，且感染率高。不同地區灰飛虱Wolbachia的感染率存在一定的差異，四川地區的感染率較其他地方相對低，這與甘波誼等［16］的報道相一致。從群體分化來看，灰飛虱體內的Wolbachia為同一群體，不存在明顯的地理種群分化，這可能與不同地區的灰飛虱群體可以經常進行基因交流有關。

三種稻飛虱體內的Wolbachia比較發現：灰飛虱與白背飛虱的wsp基因序列完全一致，而與褐飛虱存在較大差異。再次引起我們對Wolbachia如何在自然界進行傳播的思考。有報道推測可能與灰飛虱和白背飛虱的寄生蜂（Dryinid wasp）、寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）有關［10］，這兩種寄生昆蟲可能協助了Wolbachia在兩種飛虱之間的水平傳播。

三種稻飛虱在自然界具有極其相似的生活環境，寄生螯蜂（Dryinid wasp）和寄生捻翅蟲（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）同為三種稻飛虱的寄生昆蟲［16－17］，而從本研究得出的系統發育樹可以明顯看出Wolbachia在三者之間產生了種群分化。此外，從系統發育樹中還發現與灰飛虱、白背飛虱處于同一分支的還有雜擬谷盜（Tribolium confusumJacquelin du Val），一種鞘翅目擬步行蟲科昆蟲。與褐飛虱處于同一分支的還有鱗翅目的赤松毛蟲（Dendrolimus spectabilis Butler），寄生于赤松，與褐飛虱的生活習性及分布區域相差很大。怎樣的遺傳事件使不同的昆蟲具有相類似的Wolbachia，而相類似的昆蟲群體卻具有不同的Wolbachia？當然，僅僅用wsp一個基因是不足以全面反映各宿主的Wolbachia種群的關系的，這只是一方面的推測。Wolbachia在自然界中真實的傳播方式還需要從多方位、多角度進一步探索。

［1］ Hertig M.The rickettsia，Wolbachia pipientis （gen.et sp.n.）and associated inclusions of the mosquito，Culex pipiens［J］.Parasitology，1936，28：453－486.

［2］ Hilgenboecker K，Hammerstein P，Schlattmann P，et al.How many species are infected with Wolbachia？－A statistical analysis of current data［J］.FEMS Microbiology Letters，2008，281：215－220.

［3］ Fine P E M.On the dynamics of symbiote－dependent cytoplasmic incompatibility in culicine mosquitoes［J］.Journal of Invertebrate Pathology，1978，31：10－18.

［4］ Engelstadter J，Hurst G D D.The ecology and evolution of microbes that manipulate host reproduction［J］.Annual Review of Ecology Evolution and Systematics，2009，40：127－149.

［5］ Hurst G D D，Jiggins F M.Male－killing bacteria in insects：mechanisms，incidence，and implications［J］.Emerging Infectious Diseases，2000，6：329－336.

［6］ Rousset F，Bouchon D，Pintureau B，et al.Wolbachia endosymbionts responsible for various alterations of sexuality in arthropods［J］.Proceedings of the Royal Society of London Series B－Biological Sciences，1992，250：91－98.

［7］ Stouthamer R，Luck R F，Hamilton W D.Antibiotics cause parthenogenetic Trichogramma （Hymenoptera，Trichogrammatidae）to revert to sex［J］.Proceedings of the National A－cademy of Sciences of the United States of America，1990，87：2424－2427.

［8］ Hurst G D D，Hutchence K J.Host defence：getting by with a little help from our friends［J］.Current Biology，2010，20：806－808.

［9］ Kittayapong P，Jamgongluk W，Thipaksorn A，et al.Wolbachiainfection complexity among insects in the tropical rice－field community［J］.Molecular Ecology，2003，12：1049－1060.

［10］ Noda H，Koizumi Y，Qiang Z，et al.Wolbachia infection shared among planthoppers （Homoptera：Delphacidae）and their endoparasite（Strepsiptera：Elenchidae）：aprobable case of interspecies transmission［J］.Molecular Ecology，2001，10：2101－2106.

［11］ O’Neill S L，Karr T L.Bidirectional incompatibility between conspecific populations of Drosophila simulans［J］.Nature，1990，348：178－180.

［12］ Louis C，Nigro L.Ultrastructural evidence of Wolbachia rickettsiales in Drosophila simulans and their relationships with unidirectional cross－incompatibility［J］.Journal of Invertebrate Pathology，1989，54：39－44.

［13］ Casiraghi M，Bordenstein S R，Baldo L，et al.Phylogeny of Wolbachia pipientis based on glA，groELand ftsZgene sequences clustering of arthropod and nematode symbionts in the F supergroup，and evidence for further diversity in the Wolbachiatree［J］.Microbiology，2005，151：4015－4022.

［14］ Zhou W，Rousset F，O’Neill S.Phylogeny and PCR－based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences［J］.Proceedings of the Royal Society of London.Series Biological Sciences，1998，265：509－515.

［15］ 謝聯輝，魏太云，林含新，等.水稻條紋病毒的分子生物學［J］.福建農業大學學報，2001，30（3）：269－279.

［16］ 甘波誼，周偉國，馮麗冰，等.沃爾巴克氏體在中國三種稻飛虱中的感染［J］.昆蟲學報，2002，45（1）：14－17.

［17］ Kifune T，Maeta Y.New host records of Elenchus japonicus（Esaki et Hashimoto，1931）（Strepsiptera，Elenchidae）from Japan and the East China Sea［J］.Konty?，1986，54（2）：359－360.