異噁草松降解酶的定位及酶學(xué)性質(zhì)研究

劉亞光， 馮 蕾， 步金寶， 李曉雨， 李 威， 黃曉敏， 苑石磊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院水稻研究所，佳木斯 154007）

異噁草松（clomazone）是20世紀(jì)80年代FMC公司研制的一種噁唑酮類除草劑，主要作為苗前或苗后選擇性除草劑防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草［1］，因其具有對(duì)作物安全、除草廣譜、適應(yīng)性強(qiáng)、持效期長、增產(chǎn)顯著等特點(diǎn)而被推廣應(yīng)用于多種作物田［2－3］，使其應(yīng)用范圍呈不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)［4］，目前已普及應(yīng)用于甘蔗、油菜、花生、棉花等作物田［5］，但該除草劑在水中殘留至少為130d［6－7］，在土壤中持效期較長，嚴(yán)重污染土壤并對(duì)后茬作物產(chǎn)生藥害，進(jìn)而影響種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失巨大，其危害已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上迫切需要解決的問題。異噁草松在土壤中不易發(fā)生光降解和水解，其降解主要依靠微生物活動(dòng)，因此利用微生物降解殘留除草劑，是一種安全有效并切實(shí)可行的途徑［8］。

眾所周知，微生物主要通過其體內(nèi)的降解酶對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行降解，而降解不同農(nóng)藥的酶在微生物細(xì)胞中的位置不同。生物酶在生物量轉(zhuǎn)化和積累的過程中起主要作用，因此研究關(guān)鍵酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)提高生物體內(nèi)酶促反應(yīng)速度具有不可忽視的重要意義［9］。目前在農(nóng)藥酶降解領(lǐng)域研究比較廣泛的是有機(jī)磷類農(nóng)藥、菊酯類農(nóng)藥和三氮苯類農(nóng)藥等，對(duì)于異噁草松降解酶的研究還未見報(bào)道。

本課題組已篩選出的異噁草松高效降解菌W2［10］，在90d內(nèi)對(duì)土壤中異噁草松的降解率為85%，降解半衰期僅為32d，并對(duì)影響降解菌W2生物修復(fù)效果的因素進(jìn)行了研究［11］，張金花探明了異草酮高效降解菌 W2的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基［12］。本試驗(yàn)采用氣相色譜技術(shù)，對(duì)降解菌W2有效酶成分在細(xì)胞中的位置進(jìn)行分析，并對(duì)其降解酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為降解酶在田間的應(yīng)用奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，也對(duì)異噁草松農(nóng)田污染的生物修復(fù)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：異噁草松高效降解菌 W2（短桿菌屬Brevibacterium）［11］，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草與農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供，篩選自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場(chǎng)長期施用過長殘效除草劑異噁草松的地塊。

供試藥品：99.0%異噁草松標(biāo)準(zhǔn)品，哈爾濱利民農(nóng)化有限公司提供。

供試儀器：氣相色譜儀 GC－2010，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 異噁草松降解酶的提取及定位測(cè)定

參考降解菌不同細(xì)胞組分的分離方法［13］，取發(fā)酵后的菌液7 000r／min離心10min。收集上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）過濾除菌，根據(jù)無菌濾液體積加適量的（NH）2SO4粉末，混勻至飽和度為100%，4℃鹽析過夜，離心收集沉淀。用pH7.0的0.05mol／L 的 KH2PO4－NaOH 緩沖液溶解后，再用同樣緩沖液透析至無SO24－，收集透析液，得胞外粗酶液。

收集菌體，按照1g∶3mL的比例將菌體懸浮于緩沖溶液中，冰浴下應(yīng)用功率為350W的超聲波破碎儀破碎20次，每次6s，間隔8s，然后7 000r／min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，收集得胞內(nèi)粗酶液。

離心后的沉淀為菌體細(xì)胞碎片，用緩沖液重懸，得菌體細(xì)胞碎片懸浮液。

測(cè)定降解菌 W2不同組分的酶活性，確定異噁草松降解酶的位置。

1.2.2 異噁草松降解酶活力的測(cè)定方法

將2.7mL含有10mg／L異噁草松的緩沖溶液（緩沖液為0.05mol／L pH7.0的 KH2PO4－NaOH）在30℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min，加入0.3mL同樣預(yù)熱過的粗酶液，置于30℃水浴條件下反應(yīng)60min后加入1.0mol／L HCl溶液0.2mL終止反應(yīng)，以未添加酶液的處理作為對(duì)照。提取凈化反應(yīng)溶液，應(yīng)用氣相色譜儀對(duì)異噁草松進(jìn)行定量分析。在本試驗(yàn)條件下，每1min每1mL蛋白酶降解1μg異噁草松定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3 異噁草松降解酶性質(zhì)的研究

1.2.3.1 降解酶在不同酶促反應(yīng)時(shí)間對(duì)異噁草松的降解情況

于含有10mg／L異噁草松的緩沖溶液（緩沖液為0.05mol／L pH7.0的 KH2PO4－NaOH）體系中，加入降解菌粗酶液，置于30℃水浴條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)。分別在反應(yīng)0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210min終止反應(yīng)，在不同反應(yīng)時(shí)間條件下，分別設(shè)置不添加酶液處理的對(duì)照。應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定異噁草松的含量，計(jì)算降解酶對(duì)異噁草松降解率。以酶促反應(yīng)時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，異噁草松相對(duì)降解率（%）為縱坐標(biāo)，繪制進(jìn)程曲線，確定最佳酶促反應(yīng)終止時(shí)間。

1.2.3.2 酶濃度對(duì)降解酶活力的影響

在含有10mg／L異噁草松的緩沖溶液體系中分別加入0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL降解粗酶液，使最終測(cè)定酶活體系為3mL。將混合溶液置于30℃水浴條件下反應(yīng)60min后終止反應(yīng)，以未添加酶液的處理作為對(duì)照。應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定異噁草松的含量，計(jì)算降解酶活力，確定最佳粗酶液添加量。

1.2.3.3 最適酶促反應(yīng)pH的確定

在pH 值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的2.67mL磷酸鹽緩沖液中加入30μL異噁草松溶液，再各加入30℃預(yù)熱的酶液0.3mL，即刻搖勻計(jì)時(shí)，置于30℃水浴鍋中進(jìn)行酶促反應(yīng)，60min后終止反應(yīng)。在不同pH條件下，分別設(shè)置不添加酶液處理的對(duì)照。應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定異噁草松的含量，計(jì)算相對(duì)降解酶活力，確定最適酶促反應(yīng)pH。

1.2.3.4 最適酶促反應(yīng)溫度的確定

于2.7mL含有10mg／L異噁草松的緩沖溶液體系中加入0.3mL降解菌粗酶液，分別置于20、25、30、35、40、45、50 ℃水浴條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，60min后終止反應(yīng)，在不同反應(yīng)溫度條件下，分別設(shè)置不添加酶液處理的對(duì)照。應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定異噁草松的含量，計(jì)算降解酶活力，確定最適酶促反應(yīng)溫度。

1.2.3.5 異噁草松降解酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

取100mg異噁草松原藥溶于100mL 0.05mol／L pH7.5 的 KH2PO4－NaOH 緩 沖 溶 液 中，即 為1 000mg／L的母液。用移液槍分別吸取5.000、2.500、1.670、1.250、1.000、0.835、0.715、0.625mL用緩沖溶液定容至100mL，配制成濃度為50、25、16.7、12.5、10、8.35、7.15、6.25mg／L 的異噁 草松緩沖溶液體系，于2.7mL的體系中加入0.3mL酶液，于35℃水浴鍋中反應(yīng)30min。應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定異噁草松的含量，計(jì)算反應(yīng)體系中異噁草松降解速度。以異噁草松濃度的倒數(shù)（mL／mmol）為橫坐標(biāo)，以速度的倒數(shù)（min／mmol）為縱坐標(biāo)作Lineweaver－Burk圖，并計(jì)算出降解酶對(duì)異噁草松降解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

1.2.4 氣相色譜分析條件

色譜 柱：RTX－1701石 英 毛 細(xì) 管 柱，30m×0.25mm×0.25μm；進(jìn)樣口溫度：200℃；柱溫：起始溫度200℃，保持4min，以10℃／min升溫至220℃，保持4min；進(jìn)樣量：1.0μL；檢測(cè)器溫度：ECD檢測(cè)器，280℃；分流比：3.0；保留時(shí)間：10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 異噁草松降解酶的定位

微生物降解農(nóng)藥的主要作用機(jī)理是通過其分泌的降解酶，將農(nóng)藥降解為小分子物質(zhì)，已成為當(dāng)今世界各個(gè)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)［14－15］。研究表明，降解農(nóng)藥的有效酶活性物質(zhì)主要在微生物細(xì)胞內(nèi)［16］，但是胞外酶和胞壁酶等細(xì)胞其他位置的酶有時(shí)也可表現(xiàn)出降解活性［17］。分別測(cè)定 W2菌體細(xì)胞碎片懸浮液、胞外粗酶液和胞內(nèi)粗酶液對(duì)異噁草松的降解能力，確定異噁草松的降解酶的位置。以添加相同體積的緩沖液作為對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1～4。

表1 降解菌W2不同細(xì)胞組分對(duì)異噁草松的降解

由表1和圖1～4可以看出，60min反應(yīng)終止后細(xì)胞不同組分對(duì)異噁草松（10mg／L）降解效果有顯著差異，且降解率均高于對(duì)照處理。胞內(nèi)無細(xì)胞提取液的降解活性最大，降解率可達(dá)62.27%；細(xì)胞碎片懸浮液的降解活性略低，降解率為36.28%，超聲波破碎后，會(huì)有部分有效降解活性物質(zhì)殘存于細(xì)胞碎片中，或者細(xì)胞壁或膜上存在可降解異噁草松的酶；胞外粗酶液的降解活性最低，降解率為8.71%，死亡的菌體釋放到細(xì)胞外后仍會(huì)有少部分降解物質(zhì)具有活性。因此推斷降解異噁草松的有效活性物質(zhì)主要存在于微生物細(xì)胞內(nèi)，屬于胞內(nèi)酶。

圖4 胞內(nèi)酶對(duì)異噁草松的降解能力

2.2 異噁草松降解酶性質(zhì)的研究

2.2.1 降解酶酶促反應(yīng)時(shí)間的確定

應(yīng)用氣相色譜儀分別測(cè)定酶促反應(yīng)0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210min下異噁草松的含量，計(jì)算降解酶對(duì)異噁草松降解率。以酶促反應(yīng)時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，異噁草松相對(duì)降解率（%）為縱坐標(biāo)，繪制進(jìn)程曲線，以確定最佳酶促反應(yīng)終止時(shí)間。酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線如圖5所示。

圖5 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線

由圖5酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線可以看出，在30℃，0.05mol／L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，降解酶對(duì)異噁草松的降解率隨時(shí)間的增加逐漸增大。當(dāng)酶促反應(yīng)時(shí)間范圍0～60min時(shí)，異噁草松降解率與反應(yīng)時(shí)間呈直線關(guān)系，斜率明顯大于60～210min；當(dāng)時(shí)間大于60min時(shí)，曲線開始彎曲；隨反應(yīng)時(shí)間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，即酶促反應(yīng)速度下降。說明反應(yīng)初始速度的時(shí)間范圍為0～60min，因此酶活力測(cè)定應(yīng)于60min時(shí)終止反應(yīng)。

2.2.2 酶濃度對(duì)降解酶活力的影響

不同體積粗酶液的添加會(huì)導(dǎo)致酶活力反應(yīng)體系中酶濃度的變化，從而對(duì)異噁草松產(chǎn)生不同的降解效果。于3mL酶活體系中加入0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL 降解 粗 酶液 （蛋白質(zhì)含 量為0.646mg／mL），60min后終止酶促反應(yīng)，測(cè)定降解酶活力，明確最佳粗酶液添加量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 粗酶液添加量對(duì)異噁草松降解酶活力的影響

由圖6可知，不同粗酶液添加量對(duì)異噁草松降解酶活力的影響不同，在0～0.6mL范圍內(nèi)時(shí)，降解酶活力隨著酶液添加量即酶濃度的增加而增加，但增加趨勢(shì)逐漸趨于平緩；而在0.6～0.9mL范圍內(nèi)時(shí)，降解酶活力呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)榇置敢褐泻幸种飘悋f草松降解的物質(zhì)，高濃度粗酶液中夾帶更多抑制物，因此導(dǎo)致降解效果下降。方差分析結(jié)果表明，酶液添加量為0.3～0.9mL處理間無顯著差異，說明在此酶液添加量范圍內(nèi)，粗酶液濃度的變化對(duì)異噁草松的降解效果影響較小，如果考慮添加酶液成本，則應(yīng)該選擇粗酶液添加量為0.3mL。

2.2.3 最適酶促反應(yīng)pH的確定

不同酸堿條件對(duì)酶促反應(yīng)效果影響較大。調(diào)節(jié)各反應(yīng)體系pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，60min后終止酶促反應(yīng)，在不同pH條件下，分別設(shè)置不添加酶液處理的對(duì)照，計(jì)算降解酶活力，確定最適酶促反應(yīng)pH，結(jié)果如圖7所示。

圖7 pH對(duì)降解酶活力的影響

由圖7可知，不同pH對(duì)降解酶活力影響極為顯著，在5.5～7.5范圍內(nèi)相對(duì)降解酶活力隨pH的增加而增大，在pH為7.5時(shí)，相對(duì)降解酶活力最大，為1.016μg／（mL·min）；在7.5～8.5范圍內(nèi)降解酶活力逐漸下降，但下降幅度0.147μg／（mL·min）遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5.5～7.5范圍內(nèi)下降幅度0.383μg／（mL·min），說明中性偏堿性條件下降解酶活力較高。方差分析結(jié)果表明，pH為7.5時(shí)相對(duì)降解酶活力與其他pH相比差異顯著，因此異噁草松降解酶最適反應(yīng)pH為7.5。

2.2.4 最適酶促反應(yīng)溫度的確定

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響很大，在最適溫度范圍內(nèi)，降解酶活力最大，酶促反應(yīng)速度最快。調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)體系pH 值為7.5，分別置于20、25、30、35、40、45、50℃水浴條件下進(jìn)行60min后終止反應(yīng)，在不同反應(yīng)溫度條件下，分別設(shè)置不添加酶液處理的對(duì)照，計(jì)算降解酶活力，確定最適酶促反應(yīng)溫度。結(jié)果如圖8所示。

圖8 溫度對(duì)降解酶活力的影響

由圖8可以看出，異噁草松降解酶在20～50℃范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力值均高于0.7μg／（mL·min），降解酶的催化作用并沒有發(fā)生可逆性變。相對(duì)酶活力隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度升至35℃時(shí)，相對(duì)酶活力值最大為1.023μg／（mL·min），當(dāng)溫度大于35℃時(shí)，相對(duì)酶活力值迅速下降，50℃時(shí)為0.743μg／（mL·min），相較于最大值損失27.4%。經(jīng)方差分析可知，30、35、40℃處理間相對(duì)酶活力差異不顯著，而與其他處理差異顯著，說明異噁草松降解酶最適溫度范圍為30～40℃，其中最適溫度為35℃。

2.2.5 異噁草松降解酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

動(dòng)力學(xué)常數(shù)可以反映酶與底物的關(guān)系，是區(qū)別不同反應(yīng)底物的重要特征性常數(shù)。調(diào)節(jié)含有50、25、16.7、12.5、10、8.35、7.15、6.25mg／L 異噁草松溶液的酶促反應(yīng)體系pH為7.5，于35℃水浴鍋中反應(yīng)30min，計(jì)算反應(yīng)體系中異噁草松降解速度。以異噁草松濃度的倒數(shù)（mL／mmol）為橫坐標(biāo)，以速度的倒數(shù)（min／mmol）為縱坐標(biāo)作 Lineweaver－Burk圖（結(jié)果如圖9所示），根據(jù)公式計(jì)算出降解酶對(duì)異噁草松降解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

圖9 異噁草松降解酶的Lineweaver－Burk圖

由圖9可知，異噁草松降解酶的Lineweaver－Burk曲線標(biāo)準(zhǔn)方程為y＝2.265 1x＋0.847 7，相關(guān)系數(shù)R2＝0.994 2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程可計(jì)算得到降解酶米氏常數(shù)Km＝2.668×10－4mmol／mL，最大反應(yīng)速率Vmax＝0.322×10－4mmol／min。此動(dòng)力學(xué)常數(shù)反映了降解粗酶液在以異噁草松為反應(yīng)底物時(shí)的酶學(xué)性質(zhì)，是區(qū)別于其他底物的主要特征性常數(shù)。

3 結(jié)論與討論

3.1 異噁草松降解酶在細(xì)胞中位置的探討

微生物降解農(nóng)藥的實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，對(duì)于不同的農(nóng)藥來說降解酶在細(xì)胞中的位置不用，如果降解酶是胞外酶，則無菌體的富集培養(yǎng)基可以對(duì)農(nóng)藥表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解活性；如果是胞壁酶，則離心的細(xì)胞碎片懸浮液可以高效降解農(nóng)藥；如果是胞內(nèi)酶，則離心去除細(xì)胞碎片的胞內(nèi)粗提液對(duì)農(nóng)藥的降解率較高［17］。本研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)無細(xì)胞提取液的降解活性最大，其次為細(xì)胞碎片懸浮液，胞外粗酶液的降解活性最低。分析認(rèn)為胞外粗酶液會(huì)有降解活性是因?yàn)闀?huì)有一些死亡的菌體釋放到細(xì)胞外后，仍會(huì)有少部分降解物質(zhì)具有活性；細(xì)胞碎片懸浮液會(huì)有降解活性是由于經(jīng)過超聲波破碎后，會(huì)有部分有效降解活性物質(zhì)殘存于細(xì)胞碎片中，或者細(xì)胞壁或膜上存在可降解異噁草松的酶，但這種酶與胞內(nèi)酶是否屬于同一種酶、降解機(jī)理是否相同仍有待于進(jìn)一步研究。鑒于降解菌W2在降解異噁草松的過程中，胞內(nèi)無細(xì)胞提取液的降解率最大，推斷異噁草松降解酶屬于胞內(nèi)酶。

3.2 異噁草松降解酶酶學(xué)性質(zhì)研究的意義

探討降解酶酶學(xué)的性質(zhì)，對(duì)利用微生物治理異噁草松污染土壤和實(shí)現(xiàn)降解酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。酶促反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍是酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)研究的必要組成部分和重要前提條件，而反應(yīng)進(jìn)程曲線則可以很好地反映酶促進(jìn)行的時(shí)間范圍，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明在0～60min內(nèi)，以異噁草松為底物的酶促反應(yīng)一直在初速度的范圍內(nèi)進(jìn)行，且在60min時(shí)達(dá)到最大值，這為明確異噁草松降解酶的酶學(xué)性質(zhì)提供了研究基礎(chǔ)。

酶促反應(yīng)速度受酶濃度、pH和溫度等因素的影響［18］，因此本試驗(yàn)對(duì)異噁草松降解酶的粗酶液添加量、最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度分別進(jìn)行了研究，為降解酶制劑的規(guī)模化生產(chǎn)及治理土壤污染提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，底物轉(zhuǎn)化的速度隨著酶濃度的增大而加快，但是本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，粗酶液添加量為0.6～0.9mL范圍內(nèi)時(shí)，酶活力呈下降趨勢(shì)，分析認(rèn)為粗酶液中可能含有抑制異噁草松降解的物質(zhì)，高濃度粗酶液中會(huì)夾帶更多的抑制物，導(dǎo)致降解效果下降，因此應(yīng)該繼續(xù)對(duì)異噁草松降解酶的分離純化進(jìn)行研究，從而獲得更高效降解酶。在適宜的pH范圍內(nèi)，降解酶會(huì)表現(xiàn)出酶活力。異噁草松降解酶最適pH為7.5，當(dāng)pH大于或小于7.5時(shí)，酶活力都會(huì)降低，分析認(rèn)為pH會(huì)改變反應(yīng)底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，在非最適pH條件下酶與底物的結(jié)合受到阻礙而導(dǎo)致酶活力下降。在最適的酶促反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，當(dāng)溫度每升高10℃時(shí)，反應(yīng)速度可以相應(yīng)提高1～2倍，不同降解酶的最適反應(yīng)溫度不同。異噁草松降解酶最適溫度范圍為30～40℃，其中最適溫度為35℃，溫度過高或過低都會(huì)降低酶的催化效率。

動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值和Vmax是反映酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的重要特征性常數(shù)，體現(xiàn)了酶與底物結(jié)合的牢固程度和酶的特異性質(zhì)，對(duì)研究酶的主要催化方向和生理生化功能具有重要的意義。本試驗(yàn)以異噁草松為反應(yīng)底物，得到米氏常數(shù)Km為2.668×10－4mmol／mL，最大反應(yīng)速率Vmax為0.322×10－4mmol／min，這為異噁草松降解酶學(xué)性質(zhì)的深入研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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