氯嘧磺隆高效降解菌株黑曲霉（TR－H）最佳降解條件的研究

鄒月利， 陶 波

（東北農業大學，哈爾濱 150030）

氯嘧磺隆（chlorimuron－ethyl）又稱豆磺隆，是美國杜邦公司于20世紀80年代開發的一種磺酰脲類除草劑。它的化學名稱為［2－（4－氯－6－甲氧基嘧啶－2－氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸乙酯］。氯嘧磺隆為無色晶體，是一種弱酸性化合物，pKa＝4.3。該類除草劑能防治大多數闊葉雜草，對禾本科雜草也有一定的抑制效果［1－3］。此類除草劑為內吸傳導型選擇性除草劑，作用靶標為植物體內的乙酰乳酸合成酶（ALS），可有效抑制氨基酸的生物合成，導致底物α－丁酮的積累，阻礙細胞分裂期間DNA的合成，最終達到除草目的［4－5］。磺酰脲類除草劑在土壤中殘效期長，極低的殘留量就可以對后茬敏感作物產生藥害，嚴重影響種植結構的調整。同時，因其用量低、對哺乳動物低毒以及獨特的除草活性等特點而受到人們廣泛應用［6］。

磺酰脲類除草劑在土壤中的降解主要包括光解、水解和微生物降解3種途徑。其中光解作用較少，大多只發生在土壤表層；化學水解大多發生在酸性及中性土壤中；在堿性土壤中，微生物對降解起著非常重要的作用。其中，pH、溫度、濕度和土壤類型等環境因子均能影響微生物降解除草劑的除草活性［7－9］。目前，關于微生物降解除草劑的文獻很多，尤其是在水環境和土壤中降解效果顯著。因此，利用微生物降解該類除草劑污染將具有較大的應用潛力［10－12］。試驗利用本科研室篩選的高效降解菌黑曲霉（TR－H）對在不同培養條件下的氯嘧磺隆降解特性進行了深入研究，采用二氯甲烷提取，利用HPLC對反應液中氯嘧磺隆定量檢測，從而確定其最佳的降解條件。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配有自動進樣器和紫外檢測器，美國Agilent公司；KL512氮吹濃縮儀，東聯儀器設備有限公司；R－205旋轉蒸發儀，上海中勝有限公司；AL－104電子天平，瑞士梅特勒－托利多儀器公司；TGL－16G超速冷凍離心機，上海安亭儀器公司。

甲醇、二氯甲烷（進口色譜純）；娃哈哈純凈水；氯嘧磺隆標準品購自大連瑞澤農藥有限公司，純度大于97.4%；其他試劑均為分析純。真菌黑曲霉（TR－H）為東北農業大學農藥學科研室自行分離、保存的高效降解菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

液相色譜采用 Agilent－ZORBAX SB－C18色譜柱（4.6mm×150mm，5.0μm），檢測波長為254.0nm，柱溫為28.0℃，進樣體積20.0μL。流動相采用V（甲醇）∶V（水）（pH 2.5，用85.0%磷酸調節）＝75∶25，流速為0.8mL／min。

1.2.2 培養基的配制

PDA斜面培養基：取馬鈴薯200.0g，洗凈去皮后切碎，加水煮沸30.0min，用斜面菌種的培養紗布過濾后加入20.0g葡萄糖和15.0g瓊脂，蒸餾水1 000.0mL，121℃高壓滅菌15min。

察式（基礎）培養基：葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，K2HPO41.0g，KCl 0.5g，MgSO40.5g，NaNO33.0g，FeSO40.1g，蒸餾水1 000.0mL，121 ℃高壓滅菌15min［13－14］。

1.2.3 標準曲線的繪制

準確稱取純度為97.4%的氯嘧磺隆原藥0.102 6g于100mL燒杯中，加30mL甲醇溶液使之溶解，定量轉移至100.0mL容量瓶中，然后定容至刻度線，搖勻。得到氯嘧磺隆標準儲備液的濃度為1 000.0mg／L，最后用甲醇稀釋成濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0mg／L 氯嘧磺隆標準溶液，用液相色譜法進行檢測。

1.2.4 最佳培養條件的確定

向250mL三角瓶內分別裝入95.0mL不同pH的基礎培養基，用封口膜封好后，在121.0℃條件下高溫滅菌2.0h。滅菌完畢、待冷卻后，分別向基礎培養基中加入氯嘧磺隆儲備液，使其成為不同濃度的反應液。然后再加入黑曲霉種子液，以不加黑曲霉降解菌作為對照，每組設置3個重復。最后將三角瓶置于恒溫振蕩培養箱中，在150r／min的搖床上在一定溫度條件下避光振蕩培養。每隔一定時間取樣，采用液相色譜檢測，從而考察不同條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.1 接種量對降解的影響

分別加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mL黑曲霉種子液，進行降解試驗，考察不同接種量對黑曲霉種子液降解氯嘧磺隆除草劑的影響。

滿足發電運行工況通常要求改變原機組的旋轉方向，高壓側的相序也隨之改變；對于WKLF-102B勵磁裝置則必須在調節器的配置參數上作出相應調整。發電運行時有功功率方向將發生改變，由于發電工況運行時輸出的有功功率通常比較低，功率因數自動調節方式的穩定性及對電網波動的適用能力都有可能變得很差，因此，在發電運行時不建議使用電動工況的恒功率因數自動調節方式。

1.2.4.2 培養時間對降解的影響

每隔0、1、3、5、7、15d取樣，考察不同培養時間對黑曲霉種子液降解氯嘧磺隆除草劑的影響。

1.2.4.3 濃度對降解的影響

分別向基礎培養基中加入氯嘧磺隆儲備液，使其濃度分別為 1.0、10.0、50.0、100.0mg／L 和200.0mg／L的反應液，進行降解試驗，考察黑曲霉種子液對不同濃度氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.4 溫度對降解的影響

分別在20.0、25.0、30.0、35.0℃和40.0 ℃條件下，進行降解試驗，考察在不同培養溫度條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

1.2.4.5 pH 對降解的影響

緩沖溶液pH 分別為5.0、7.0、9.0的反應液，以不調pH為對照，進行降解試驗，考察在不同pH條件下黑曲霉種子液對氯嘧磺隆除草劑的降解作用。

每隔一定時間，在無菌操作臺上取樣5.0mL降解液于10.0mL離心管內；在15 000r／min、4℃條件下離心10.0min后取上清液3.0mL，加1.0g固體氯化鈉（防止乳化），搖勻、使之完全溶解后，加5.0mL（3.0mL＋2.0mL）二氯甲烷萃取2次、合并有機層，加0.5g左右的無水硫酸鈉干燥，將上清液轉移到新的離心管內，然后用氮氣吹干，用甲醇定容至1.5mL。最后用0.45μm的微孔濾膜過濾，用HPLC測定其降解率。

2 結果和討論

2.1 方法的線性

根據液相色譜測定結果，以氯嘧磺隆除草劑原藥的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制工作曲線（如圖1）。得到回歸方程y＝25.837x－2.196，相關系數為R＝0.999 9（n＝3）。結果表明，氯嘧磺隆除草劑在0.1～200.0mg／L范圍內具有良好的線性關系，可以滿足定量分析的要求。

圖1 氯嘧磺隆的標準工作曲線

2.2 最佳培養條件的測定結果

2.2.1 接種量對降解的影響

待反應液培養7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖2）。結果表明，黑曲霉接種量在4.0～7.0mL時降解率變化較平緩，而在1.0～4.0mL和7.0～10.0mL時降解率的變化幅度較大。該結果表明，黑曲霉的接種量為5.0mL左右時氯嘧磺隆降解速率最大，降解率最高能達到96.49%。

2.2.2 培養時間對降解的影響

將反應液每隔0、1、3、5、7、15d測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖3）。結果表明，反應液培養1d時黑曲霉菌株的降解率為22.80%，培養7d時降解率為96.25%，培養15d時降解率為98.06%。該結果表明，黑曲霉菌株在培養24h時開始降解氯嘧磺隆，培養到7d即可將氯嘧磺隆基本降解完全。

2.2.3 濃度對降解的影響

待反應液培養7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖4）。結果表明，黑曲霉菌株在含有濃度依次為1.0、10.0、50.0、100.0mg／L氯嘧磺隆培養基中的降解能力明顯高于在含有200.0mg／L氯嘧磺隆培養基中的降解力，其中氯嘧磺隆含量為10.0mg／L培養基的降解率最高，為96.49%。隨著氯嘧磺隆濃度的增加，黑曲霉降解除草劑的能力逐漸降低，當氯嘧磺隆的濃度增加到200.0mg／L時，降解率為90.79%。

2.2.4 溫度對降解的影響

待反應液培養7d時測定氯嘧磺隆的降解率，得到降解曲線（如圖5）。結果表明，反應液的溫度為20.0℃時，氯嘧磺隆的降解率為84.74%。隨著反應液溫度的升高，黑曲霉菌株對氯嘧磺隆的降解速率隨之增加，當溫度升至30.0℃左右時降解率最高，為97.21%。

2.2.5 pH 對降解的影響

將反應液每隔0、1、3、5、7d測定氯嘧磺隆的降解率，繪成降解曲線（如圖6）。結果表明，氯嘧磺隆在pH為7.0的反應液降解效率最低，在對照培養基中氯嘧磺隆的降解率最高，在pH為5.0和9.0的反應液降解速率基本相同。

圖6 不同pH對黑曲霉降解氯嘧磺隆作用的影響

3 結論

試驗系統地研究了在不同影響因素條件下，真菌黑曲霉對氯嘧磺隆降解作用的影響。確立了黑曲霉在基礎培養基中最適宜的培養條件：氯嘧磺隆濃度 為 10.0mg／L、溫 度 為 30.0 ℃、接 種 量 為5.0mL。雖然該菌株的最適培養溫度為30.0℃，但在25.0℃和40.0℃時仍保持較好的降解活性。所以，該菌株在治理受氯嘧磺隆污染的土壤以及地下水和工業廢水等方面將具有較大的應用潛力［15］。

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