蠶豆赤斑病病原菌鑒定

黃 燕， 段燦星， 陸 鳴， 東方陽＊， 朱振東＊

（1.河北科技師范學院生命科技學院，昌黎 066600；2.中國農業科學院作物科學研究所，國家農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程，北京 100081）

蠶豆赤斑病是一種重要的蠶豆葉部病害，廣泛發生在世界各蠶豆產區，嚴重發生時可導致50%～100% 的產量損失［1］。蠶豆赤斑病由蠶豆葡萄孢（Botrytis fabae Sardina）、灰 葡 萄 孢 （B.cinerea Pers.ex Fr.）、擬蠶豆葡萄孢（B.fabiopsis Zhang et al）3種病原菌引起［1－3］。蠶豆葡萄孢被認為是引起赤斑病的主要病原菌，它主要侵染植物的葉、莖、花和豆莢，發病初期葉片上產生紅褐色小斑點，后擴大成圓形或橢圓形病斑［4］；灰葡萄孢是引起蠶豆赤斑病的另一病原菌，多在花期侵染花部，引起花和幼莢枯死，或因被侵染的花脫落導致葉片感染形成大型病斑，最終使整個葉片變黑、枯死［4］；擬蠶豆葡萄孢是新發現的一個病原菌，目前僅在我國湖北報道，其對蠶豆的危害與蠶豆葡萄孢相似［3］。本研究對我國一些主要蠶豆產區蠶豆赤斑病病原菌進行鑒定，以期為蠶豆赤斑病的流行、防治、抗性資源篩選和抗病品種選育提供有價值的信息。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離

2010－2011 年在蠶豆生長期分別在甘肅省、青海省、江蘇省、四川省、重慶市、河北省等蠶豆主產區采集蠶豆赤斑病植株樣品（表1）。用常規組織分離法分離病原菌。參照陸家云［5］描述將鑒定為葡萄孢的分離物（Botrytis spp.）進行單孢分離。蠶豆赤斑病3種病原菌的標準菌株蠶豆葡萄孢菌株BC－25、灰葡萄孢菌株BC－27和擬蠶豆葡萄孢菌株BC－2由華中農業大學李國慶教授提供。

1.2 葡萄孢分離物形態特征

參照張靜［6］的方法鑒定葡萄孢分離物。將分離物接種于PDA平板，20℃恒溫條件下培養4d后，用滅菌的直徑6mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，然后將菌餅菌面朝下接種到PDA平板中央，每個分離物設3個重復，于20℃的恒溫培養室中培養，觀察菌落的形狀、顏色及菌核和分生孢子的產生。15d后計算菌核產量和測量菌核直徑。

選取蠶豆葡萄孢、灰葡萄孢和擬蠶豆葡萄孢分離物各10株，轉移到PDA平板（每皿15mL）進行活化，在20℃條件下培養室中培養3d后轉移到另一裝有近紫外燈的培養室連續培養7d（12h光照／12h黑暗），再轉入4℃冰箱培養10d，觀察分離物的產孢情況，顯微鏡下（Olympus CX31，Japan）測量分生孢子及孢子梗的長度，掃描電鏡觀察分生孢子形態。

1.3 致病力測定

采用離體葉片的方法進行致病力測定［7］。分離物在PDA培養基20℃條件下培養4d后，用滅菌的直徑6mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，在超凈工作臺中將菌餅菌面朝下接種到新鮮健康的蠶豆葉片上（‘成胡17號’，由四川省農業科學院提供）。接種前先用自來水沖洗葉片表面，然后放入鋪有濕潤濾紙的方形塑料盒子（12cm×12cm×1.5cm）中，每個分離物接種3個葉片，以PDA培養基為對照，20℃條件下放培養箱中光暗交替（12h∥12h）培養，每日觀察病斑生長情況，3d后量取病斑直徑。

1.4 特異PCR檢測

將分離物在鋪有滅菌玻璃紙的PDA上培養，3 d后收集菌絲，參照M?ller等方法提取DNA［8］。利用檢測蠶豆葡萄孢和灰葡萄孢特異性引物對C729＋／ C729－（5′－AGCTCGAGAGAGATCTCTGA－3′／5′－CTGCAATGTTCTGCGTGGAA－3′）、灰葡 萄 孢 特 異 引 物 對 BC108＋／BC563－（5′－ACCCGCACCTAATTCGTCAAC－3′／5′－GGGTCTTCGATACGG－GAGAA－3′）對分離物基因 DNA 進行 PCR 擴增［9－10］。PCR采用20μL反應體系：10×Buffer緩沖液（含Mg2＋）2.0μL，dNTPs（10mmol／L）0.5μL，上下游引物 （10μmol／L）各 0.6μL，Taq 酶 （2U／μL）0.5μL，DNA 模板50ng，滅菌雙蒸水14.8μL。PCR擴增反應采用touch down程序：95℃預變性4min（1個循環）；94℃變性40s，53℃退火40s，72℃延伸1min（10個循環，每個循環降低0.3℃）；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min（27個循環），72℃預延伸10min（1個循環），擴增后的產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在UV紫外光下觀察PCR擴增情況，用凝膠成像分析系統（Tanon 4100，上海）拍照并保存，PCR擴增及電泳檢測分別重復兩次。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學鑒定

從6個省（市）的20個縣區共分離到304個葡萄孢屬分離物。通過與蠶豆赤斑病病原菌標準菌株的比較和參考張靜［6］的研究結果將這些分離物鑒定為3個葡萄孢種，其中84個分離物為蠶豆葡萄孢、100個為灰葡萄孢、120個為擬蠶豆葡萄孢，分離頻率分別為27.6%、32.9%和39.5%（表1）。在江蘇省、重慶市、四川省和河北省，以擬蠶豆葡萄孢分離頻率為最高，分別為46.0%、57.6%、43.9%和51.4%；甘肅省以灰葡萄孢分離物比例最高，為47.0%；青海省以蠶豆葡萄孢分離頻率最高，為41.3%。

在20℃恒溫條件下培養，蠶豆葡萄孢在PDA培養基上菌落白色，菌絲繩索狀，后期產生褐色至黑色小菌核，菌核圓形至橢圓形，菌核散布整個培養皿，大小為（0.5～6.2）mm×（0.3～4.5）mm，平均產量（500±50）個／皿。分生孢子單胞，倒卵形，透明至灰白色，大小為（10.6～24.3）μm×（8.2～16.5）μm，孢子梗直立，頂端分枝，大小為（836.0～1823.0）μm×（13.0～20.0）μm（圖1）。

灰葡萄孢菌絲體白色，比較濃密，菌核黑色，形狀不規則，散亂分布于整個培養皿，灰葡萄孢菌核大小為（1.2～11.9）mm×（1.1～5.8）mm，平均每皿（60±20）個菌核。灰葡萄孢在PDA培養基直接可以產生孢子，分生孢子單胞，橢圓形，無色至淡褐色，大小為（6.3～17.2）μm×（4.8～11.4）μm，孢子梗蓬松，單生或叢生，大小為（767.0～1784.0）μm×（5.0～15.0）μm（圖1）。

擬蠶豆葡萄孢菌絲絨毛狀，菌落白色至灰白色，菌核形狀不規則，球形或橢圓形，菌核排列比較規則，呈同心環狀或輪紋狀，菌核大小為（1.9～12.1）mm×（1.5～5.9）mm，平均產量（140±30）個／皿。分生孢子單胞，透明，表面不光滑，卵圓至橢圓形，大小為（14.8～26.2）μm×（8.9～20.1）μm，孢子梗大小為1 459.0μm×（13.0～18.0）μm（圖1）。

表1 不同省份葡萄孢分離物的種類及分離頻率

圖1 三種葡萄孢分離物的菌核產生、孢子梗和分生孢子形態

2.2 致病力測定

對304個葡萄孢分離物進行致病性測定，所有分離物對蠶豆品種‘成胡17號’均致病。接種3d后接種葉片產生大小不同的黑色病斑。將病斑直徑大于20mm的歸為強致病力，小于7mm的為弱致病力，介于兩者之間的為中等致病力，在304個分離物中，強致病力分離物有232個，其中蠶豆葡萄孢60個，灰葡萄孢74個，擬蠶豆葡萄孢98個，分別占每種葡萄孢分離物的71.4%、74.0%和81.7%；中等致病力分離物44個，其中蠶豆葡萄孢18個，灰葡萄孢17個，擬蠶豆葡萄孢9個，分別占每種葡萄孢分離物的21.4%、17.0%和7.5%；弱致病力分離物28個，包括蠶豆葡萄孢6個，灰葡萄孢9個，擬蠶豆葡萄孢13個，分別占每種葡萄孢分離物的7.1%、9.0%和2.5%（圖2）。

圖2 蠶豆赤斑病病原菌分離物致病力測定

2.3 特異PCR檢測

利用特異引物BC108＋／563－和引物C729＋／C729－對分離物基因組DNA進行PCR擴增，引物BC108＋／563－在灰葡萄孢分離物中擴增480bp單一條帶，在蠶豆葡萄孢和擬蠶豆葡萄孢分離物中不擴增；引物C729＋／C729－在灰葡萄孢和蠶豆葡萄孢分離物中擴增600bp單一條帶，在擬蠶豆葡萄孢分離物中不擴增（圖3）。通過特異PCR檢測，在304個分離物中，100個分離物為灰葡萄孢，84個分離物為蠶豆葡萄孢，120個分離物為擬蠶豆葡萄孢，該結果與形態學觀察結果一致。

圖3 葡萄孢分離物的PCR檢測

3 結論與討論

基于菌落、菌核和分生孢子特征并結合致病性及特異性PCR檢測結果將分離自甘肅省、青海省、江蘇省、河北省、四川省和重慶市6個省市共20個區縣的304個蠶豆赤斑病病原菌分離物鑒定為3個葡萄孢種：蠶豆葡萄孢、灰葡萄孢和擬蠶豆葡萄孢，其中以擬蠶豆葡萄孢分離頻率最高，為39.5%。擬蠶豆葡萄孢為最近被鑒定的一個新蠶豆赤斑病病原菌，目前只 在 湖 北 省 有 報 道［3－6］。 張 靜［6］研 究 表 明：擬蠶豆葡萄孢在湖北省分布廣泛，在調查的56個縣市中有35個分離到該病原菌，分離頻率為36.4%。本研究結果表明，在江蘇省、河北省、四川省和重慶市蠶豆赤斑病病原菌分離物中擬蠶豆葡萄孢分離物的分離頻率最高，分別為46%、51%、44%和58%，表明該菌是引起這些地區蠶豆赤斑病的主要病原菌。

在甘肅省，灰葡萄孢分離物的分離頻率最高，為47.0%，擬蠶豆葡萄孢和蠶豆葡萄孢分離物的分離頻率相近，分別為24.2%和28.8%。這一結果與甘肅省的一些地區發生蠶豆灰霉病有關。2010年7月中旬，作者在甘肅省進行蠶豆病害調查時發現，在康樂縣、臨夏州的一些蠶豆田發生一種新的蠶豆病害—蠶豆灰霉病，該病癥狀為蠶豆上部葉片從葉尖和葉緣開始焦枯，壞死組織上產生灰霉層，但無赤斑病癥狀。甘肅省蠶豆大多種植在冷涼濕潤地區，氣候條件適合作物灰霉病的發生。

張靜［6］的研究表明，擬蠶豆葡萄孢比蠶豆葡萄孢和灰葡萄孢具有更寬的生長溫度范圍和pH范圍，雖然寄主范圍相對較窄，但對蠶豆的致病力與蠶豆葡萄孢相近。隨著全球氣候變暖，擬蠶豆葡萄孢的較大溫度范圍適應性特性，其對蠶豆的危害程度有可能進一步加劇，應該引起重視。

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