甘肅省馬鈴薯炭疽病的鑒定及室內藥劑篩選

楊成德， 姜紅霞， 陳秀蓉＊， 薛 莉， 蒲崇建， 滕學琴， 孟向榮

（1.甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 甘肅省草業工程實驗室中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅農業大學農學院，蘭州 730070；3.甘肅省植保植檢站，蘭州 730020）

馬鈴薯（Solanum tuberosumLinn.）屬茄科作物，主要作糧食、蔬菜和飼料。據聯合國糧農組織（FAO）統計，全世界所有糧食作物中，馬鈴薯總產量排名第四。甘肅省87個縣（市、區）中有60個縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉”之稱，馬鈴薯是當地農民的主要經濟來源，也是該地區發展經濟的支柱產業之一。馬鈴薯炭疽病（black dot disease）廣泛分布于英國、意大利、加拿大和美國等50多個國家和地區［1］，可以發生在馬鈴薯的各個生長部位，如地下部分（子塊莖、匍匐枝、根）、莖基部及葉部［2］；該病菌侵染根部能引起根的腐爛，侵染維管束造成萎蔫，嚴重時引起皺縮和枯萎，與黃萎病（Verticillium dahliae Kleb.）等復合侵染時可引起馬鈴薯的早 衰 病 （potato early dying，PED）［3］；據 Tsror等［4］報道，在1994－1996年所試驗的5個馬鈴薯品種中，該病害使馬鈴薯減產22%～30%，但不同年份的影響有差異，且接種病原菌后對馬鈴薯塊莖品質的影響也不同。馬鈴薯炭疽病由半知菌亞門炭疽菌屬的球炭疽菌［Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes］引起［5］，該病菌抗逆能力強，存活時間長，能以小菌核的形式在塊莖表面和內部長期存活，還可存活于其他營養體上［6］。據2010年和2011年調查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省定西市安定區、渭源縣、隴南市武都區和武威市天祝縣等地發生較重，重病田病株率在30%以上，導致植株早枯，且貯藏期引起爛窖，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質，已成為馬鈴薯的主要病害之一。馬鈴薯炭疽病在國內以前作為檢疫對象，在生長期及貯藏期的研究資料較少。因此，本試驗通過在甘肅省不同馬鈴薯種植區采集標樣，進行癥狀觀察和通過形態學特征及ITS序列分析鑒定了病原，并進行了室內毒力測定，以期為該病害的識別和防控提供依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試標本：采集于定西市安定區、隴南市武都區和武威市天祝縣馬鈴薯病田及馬鈴薯貯藏庫。

供試儀器：水平凝膠電泳裝置（Bioneer公司）；MyGenie32Thermal Block PCR熱循環儀（Bioneer公司）；凝膠成像系統 Uvitec A－6030（Bioneer公司）；高速冷凍離心機（Biometra公司）等。

供試生化試劑：蛋白酶K、溶菌酶、DNATaq聚合酶和LD2000Marker購于上海生工生物技術公司；其他試劑均采用國產分析純。選用通用引物ITS1和ITS4（上海生物工程有限公司合成）為擴增引物，引物序列分別如下，ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C；ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。

供試化學農藥：70%丙森鋅可濕性粉劑（天津市阿格羅帕克農藥有限公司）；70%代森錳鋅可濕性粉劑（天津施普樂農藥技術有限公司）；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（新加坡利農私人有限公司）；75%百菌清可濕性粉劑（利民化工有限責任公司）；10%苯醚甲環唑水分散粒劑（先正達作物保護有限公司）；32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑（先正達作物保護有限公司）；30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油（先正達作物保護有限公司）；1.5%噻霉酮水乳劑（陜西西大華特科技實業有限公司）；50%嘧菌酯懸浮劑（英國先正達有限公司）；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（拜耳作物科學公司）；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（德國先靈農業化學有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標本采集和分離

在2009年8月和2010年3月在甘肅省馬鈴薯主要種植區的馬鈴薯田間和貯藏庫中分別采集不同時期的發病植株和塊莖，進行癥狀描述，后進行常規組織分離培養，將分離獲得的真菌鏡檢，炭疽菌屬真菌進行致病性測定。

1.2.2 病原物致病性測定

在健康生長的馬鈴薯植株莖稈上，用撥針造成微傷，再將菌液噴霧于微傷口處，保濕48h之后置于良好的生長環境中，定期觀察接菌馬鈴薯植株，形成典型癥狀后進行再分離和鑒定，以接種無菌水為對照。經致病性測定具有致病能力的病原物進行以下試驗。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

將培養10～15d的炭疽病菌或發病部位病原菌制片，光學顯微鏡（10×40倍）下觀察孢子形態、分生孢子盤及剛毛的特征，測定分生孢子、分生孢子盤和剛毛的大小（測定50個），并拍照。根據病原形態特征，參考相關資料［7－8］，確定屬種。

1.2.3.2 ITS序列鑒定

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，在28℃、150r／min條件下振蕩培養5～7d后收集菌絲體，采用上海生物工程有限公司的UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取炭疽病菌基因組DNA，取5μL電泳檢查提取結果。rDNA－ITS的擴增利用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物ITS1（TCC GTA GGT GAA CCT GCG C）和ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC）進行PCR擴增。擴增使用50μL擴增體系，即為：10×PCR Buffer 5.0μL，TaqDNA 聚 合 酶 （2U／μL）1.2μL，ITS1（10mmol／L）2.0μL，ITS4（10mmol／L）2.0μL，dNTP（10mmol／L）3.0μL，DNA 模板（10ng／μL）2.0μL（以加2.0μL ddH2O為陰性對照），ddH2O 34.8μL。擴增程序：94 ℃ 預變性3min，30個循環中，94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸8min。擴增后取5μL擴增產物電泳檢查擴增結果，具特異性條帶的擴增產物送上海生物工程有限公司測序。所測序列進入 GenBank數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）進行相似性分析，并與GenBank中的相似序列在Clustal（1.81）程序包中進行多重序列匹配排列（multiple alignmemts）分析，形成一個多序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“－”填補，用 Mega（4.0）程序包中的Neighbor－Joining法構建系統發育樹。

1.2.4 病原菌的室內毒力測定

根據預試驗結果，供試殺菌劑的試驗濃度分別為肟 菌 · 戊唑醇 90、45、22.5、11.25μg／mL 和5.63μg／mL；噻霉酮24、12、6、3μg／mL和1.5μg／mL；嘧菌酯49.92、24.96、12.48、6.24μg／mL 和3.12μg／mL；丙環唑 · 苯醚甲 環 唑 1.94、1.52、1.164、0.766μg／mL和0.388μg／mL；苯醚甲環唑8、6.4、4.8、3.2μg／mL 和1.6μg／mL；苯醚甲環唑·嘧 菌 酯 4.06、3.25、1.44、1.62μg／mL 和0.81μg／mL；咪鮮胺錳鹽8.75、7、5.25、3.5μg／mL和1.75μg／mL；精甲霜·錳鋅2 560、1 280、640、320μg／mL和160μg／mL；丙森鋅80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；代森錳鋅80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；百菌清80、56、32、16μg／mL和8μg／mL；甲基硫菌靈80、56、32、16μg／mL和8μg／mL。

采用生長速率法測定不同藥劑對馬鈴薯炭疽病菌的抑制率［9］。將供試菌株接種到PDA平板培養基上，置于培養箱內30℃培養5～7d，用打孔器打取直徑4mm的菌餅接種于相應濃度的含藥PDA平板培養基中央，置于生化培養箱中30℃ 恒溫培養，3次重復，以加等量無菌水的平板培養基為對照；4d后每天用十字交叉法測量菌落直徑，計算各藥劑對馬鈴薯炭疽病菌的抑制率、毒力回歸方程和EC50。

2 結果與分析

2.1 癥狀描述

馬鈴薯炭疽病在塊莖、莖稈、葉片等部位均可發生。馬鈴薯根部和匍匐枝上發病時出現大量黑色的斑點狀分生孢子盤，且分生孢子盤上褐色剛毛明顯（圖1a）；塊莖發病形成近圓形或不規則形大斑，呈褐色或灰色（圖1b），后逐漸褐色腐爛，略下陷，病健交界明顯，其上有黑色小點，為病原菌形成的分生孢子盤。葉部發病癥狀多不明顯，偶爾早期顏色變淡，在葉柄和小葉上形成褐色至黑褐色病斑；在生長中期可在莖稈上形成褐色條形病斑且不斷擴大（圖1c），其上也可以形成分生孢子盤，后期莖稈逐漸萎蔫并枯死，在枯死的莖稈外表皮或皮層內部形成大量的黑色顆粒狀物，為小菌核（圖1d）。

2.2 病原菌的分離與致病性測定

經常規組織分離培養，在顯微鏡下檢查分離物，所有分離物中只有一種炭疽菌屬的真菌，在PDA培養基上該菌新鮮菌絲無色，老菌絲呈淺褐色，在培養皿中央形成大量黑色分生孢子盤和小菌核（圖2），將該分離物接種于馬鈴薯進行致病性測定。

在接種后的馬鈴薯植株莖稈上，約30d后出現馬鈴薯炭疽病的典型癥狀（圖3）。初期形成褐色斑點，之后莖稈上逐漸形成灰褐色條形斑，且不斷擴大，后期莖稈逐漸萎蔫并枯死，并且壞死部分呈灰白色，而在枯死的莖稈表面形成大量的黑色顆粒狀物，鏡檢為病原菌的分生孢子盤，且與所接種的病原菌形態一致，在PDA培養基上再次分離得到了該病原菌。因此，確定該分離物為馬鈴薯炭疽病的病原物，并對該菌進行了以下試驗。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原形態學鑒定

該菌菌絲無色至淺褐色，有隔膜，分生孢子盤黑褐色，長88～120μm（平均109.0μm），常生于寄主表皮下，盤上產生褐色、有分隔、頂部漸尖的剛毛6～7根，長40～90μm（平均61.8μm），分生孢子梗無色，具分隔，緊密排列在分生孢子盤上，單個頂生分生孢子；分生孢子無色，單胞，長橢圓形或桿狀，大小為（16～19）μm（17.3μm）× （3.6～4.8）μm（4.3μm）（圖4右圖中箭頭所指）。

根據病原形態特征，參考相關文獻［7－8］鑒定該菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）腔孢綱（Coelomycetes）黑盤孢目（Melanconiales）炭疽菌屬（Colletotrichum）的球炭疽菌［Colletotrichum coccodes（Wallr.）Hughes］。

圖4 馬鈴薯炭疽病病原形態

2.3.2 病原菌的ITS序列鑒定

采用UNIQ－10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取炭疽病菌基因組DNA，經電泳檢測，有兩個重復其特異性、純度和完整性能滿足PCR擴增的要求（圖5）。

圖5 炭疽病菌基因組DNA電泳

在引物ITS1和ITS4的引導下，PCR擴增30個循環，產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker－DL2 000為對照，在500bp附近有一條明顯的特異性擴增條帶，即為獲得的目的ITS rDNA片段（圖6），將該擴增產物送上海生工測序。

圖6 炭疽病菌ITS rDNA PCR電泳

將所測定的炭疽病菌的ITS rDNA序列輸入GenBank中比對后，與EU400141.1 Colletotrichum coccodes、HM171679.1 Colletotrichum coccodes 和FJ545227.1 Colletotrichum coccodes等7個序列相似性在100%，搜索下載這些相似性最高的序列，并使用Clustal（1.8）進行多重序列比較，再用 Mega 4.0軟件以最大簡約法（Neighbor－Joining，NJ）構建系統發育樹（圖7），炭疽病菌在系統發育樹中與EU400141.1（570bp）Colletotrichum coccodes聚在一起，其為2008年由加拿大學者上傳，說明其親緣關系最近。該結果從分子水平進一步鑒定該病原菌為Colletotrichum coccodes，該病害為馬鈴薯炭疽病。

圖7 炭疽病菌系統發育樹

2.4 馬鈴薯炭疽病菌的室內藥劑篩選

2.4.1 對馬鈴薯炭疽病菌菌絲的抑制效果

表1表明，75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑90μg／mL抑菌率最高，達91.65%，68%精甲霜·錳鋅可濕性粉劑抑菌作用較差，2 560μg／mL時抑菌率為84.33%，160μg／mL時僅為16.04%。12種供試藥劑在試驗濃度下對炭疽病菌菌絲的生長均有不同程度的抑制作用，其抑制率隨濃度的增大而增加，不同藥劑間抑制率也差異明顯。

2.4.2 12種殺菌劑的毒力比較

表2表明，所選的12種化學農藥對馬鈴薯炭疽病菌都有一定的抑制效果，其中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑、30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑的EC50（μg／mL）值小于10，說明馬鈴薯炭疽病菌對這幾種藥劑非常敏感；50%嘧菌酯懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑的 EC50在10μg／mL到85μg／mL之間，小于100μg／mL，即馬鈴薯炭疽病菌對這幾種藥劑較敏感；68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑的抑制效果較差，其EC50為734.30μg／mL，說明馬鈴薯炭疽病菌對該藥劑敏感性較差。該結果表明70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑、30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑在理論上為馬鈴薯炭疽病化學防治中較好的化學農藥。12種不同藥劑的EC50（μg／mL）值由小到大依次為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑＜10%苯醚甲環唑水分散粒劑＜30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油＜32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑＜75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑＜50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑＜1.5%噻霉酮水乳劑＜50%嘧菌酯懸浮劑＜75%百菌清可濕性粉劑＜70%丙森鋅可濕性粉劑＜70%代森錳鋅可濕性粉劑＜68%精甲霜·錳鋅水分散粒劑。

表1 12種殺菌劑對馬鈴薯炭疽病菌的相對抑制率1）

表2 12種殺菌劑對馬鈴薯炭疽病菌的毒力測定

3 討論與結論

馬鈴薯炭疽病除了危害馬鈴薯外，還可以侵染包括葫蘆科、茄科等13個科的35種寄主，在我國僅吉林省和山東省有記錄［10］。其病原球炭疽菌（C.coccodes）以小菌核的形式在塊莖、作物的碎屑或土壤中存活很長時間，53%的小菌核埋藏在松軟的土層2.5cm下，在潮濕的條件下可以存活83周［11］；受侵染的塊莖種植在田間后，植株表現為生長緩慢，莖部、子塊莖都顯示病癥。Cullen等［6］用PCR技術分別從英國3個地區的5年、8年、13年未種植過馬鈴薯的土壤中檢測到了該病菌的存在，證實了土壤是該病菌一種主要的侵染來源，即土壤帶菌就成為一種有效的接種體［12］。據2010年和2011年調查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省多個縣（區）馬鈴薯生長期和貯藏期發生，發病輕的田塊生長不良，發病重的田塊植株早枯，嚴重影響馬鈴薯的產量和品質，同時進入貯藏期造成塊莖腐爛，其已成為甘肅省馬鈴薯生產上的重要病害之一。本試驗室內毒力測定中70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、10%苯醚甲環唑水分散粒劑、30%丙環唑·苯醚甲環唑乳油、32.5%苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑、1.5%噻霉酮水乳劑對馬鈴薯炭疽病菌的EC50較小，理論上為防治效果較好的化學農藥；50%嘧菌酯懸浮劑、75%百菌清可濕性粉劑、70%丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑對馬鈴薯炭疽病也有一定的防治效果。該結果為馬鈴薯炭疽病的化學防治提供了理論依據。

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