一株脂肽產生菌發酵參數的響應曲面法優化

單大鵬，李 旭，產竹華，劉 洋，邵宗澤

（1.國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門，361005；2.國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門，361005；3.福建省海洋生物技術重點實驗室，福建 廈門，361005）

石油是土壤及海洋中的重要污染物之一，海洋溢油將經歷溶解、揮發、光化學氧化分解、吸附、沉降、以及生物降解等一系列過程，其中生物降解是徹底消除油污的最重要途徑，利用微生物降解作用來主動清除溢油的生物修復技術是當今非常重要的環境生物技術［1］。生物表面活性劑具有滲透、潤濕、脫附、乳化、增溶、穩泡和消泡等作用［2］，有助于溶解難溶的石油烴化合物，提高石油烴污染物的降解率，因而在石油污染的治理中具有很好的應用前景［3］。在復雜環境條件（高鹽、酸堿、高溫等）下，仍能保持乳化作用的生物表面活性劑將具有更廣泛的適用性。

生物表面活性劑的分子結構包括非極性的疏水部分和極性的親水部分，具有兩親性質［4－5］，其疏水部分為飽和、不飽和或羥化的烴鏈；其親水部分有多種形式，如糖類、氨基酸類、環狀肽類、磷酸鹽、醇等，它們一般都具有良好的降低表面張力和界面張力的性能［6］。生物表面活性劑最主要的是脂肽、糖脂、磷脂等，其中脂肽一般為胞外產物，離去菌體后存在于上清或者疏水層中［7－8］。現在發現的脂肽主要來自Bacillus屬，如B.subitilis，B.circulans，B.cereus，B.polymyxa，B.mesentericus等。除了Bacillus產生脂肽外，其他一些種類的微生物也產脂肽。例如Mycobacteriumfortuirum，Streptomycescanus，Pseudomonasfluorescens，Serratiamarcescens等［9］。

生物表面活性劑一般產量很低，純化成本高，因而限制了實際應用［10］。優化發酵工藝是提高生物表面活性劑產量的主要途徑之一。Plackett－Burman法可以從多個因素中快速確定其中最為關鍵的發酵參數，Willians曾將該方法與隨機平衡實驗、部分因子實驗相比較，認為Plackett－Burman法在篩選試驗重要因子方面最為有效和準確［11］。響應面分析法中的Box－Behnken中心組合設計是一種三水平的實驗設計法，適用于2～5個因素的優化實驗［12］。由于該方法的試驗次數均在因素數的4倍以上，一般都能獲得良好的擬合結果［13］。

渤海岸邊污染土壤中篩選獲得表面活性劑產生菌BO2，對其進行了菌株的鑒定及生理生化分析，并利用Plackett－Burman和Box－Behnken試驗，確定產生表面活性劑的最佳培養條件和培養基組成，為工業化生產的工藝優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株

菌株BO2，于2010－07分離自渤海東營港5號碼頭油污染土壤，并以玻璃管形式、－80℃低溫保藏于本實驗室。

1.2 培養基與試劑

分離、純化培養基采用2216E培養基：酵母粉1g·L－1，胰蛋白胨5g·L－1，磷酸鐵0.01g·L－1，瓊脂16g·L－1（液體培養基不加瓊脂），天然海水1 000mL，pH 7.6，121℃濕熱滅菌20min。

發酵培養基：酵母粉2g·L－1，胰蛋白胨10g·L－1，NH4NO31g·L－1，液體石蠟40mL·L－1，大豆油40mL·L－1，MgSO40.5g·L－1，KH2PO41g·L－1，FeSO40.28mg·L－1，SrCl20.01g·L－1，天然海水1 000mL，pH 7.6。121℃濕熱滅菌20min。FeSO4·7H2O溶液經0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到滅菌后的培養基中。

蛋白胨、酵母粉、液體石蠟、大豆油（市售）；柴油（市售零號柴油）；NaCl，KH2PO4，FeSO4·7H2O，MgSO4，NH4NO3，FePO4，SrCl2，HCl，NaOH均為分析純。甲醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸、茚三酮均為分析純。

1.3 菌株的鑒定及生理生化分析

1）革蘭氏染色：菌株接種于2216E固體培養基平板上，37℃培養24h后，進行革蘭氏染色并鏡檢［14］。

2）電鏡觀察：取培養24h的新鮮菌體用無菌生理鹽水重懸菌體，6 000r／min離心5min棄上清，再用無菌超純水重懸菌體，6 000r／min離心5min棄上清，將離心后的菌體用磷鎢酸溶液制成懸液點在200目的銅網上，吸附3～5min后用干凈的濾紙吸去多余菌液，在白熾燈下干燥1h后上透射電鏡（日本電子公司JEM－1230）觀察，加速電壓設定為120kV并拍照。

3）生理生化鑒定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》測定菌株對糖醇利用、產酸產氣、生長溫度、pH范圍、耐鹽試驗、溶菌酶抗性、V－P測定、接觸酶反應、吲哚反應、明膠穿刺、淀粉水解、硝酸鹽還原、厭氧生長、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶活性、酪素水解和酪氨酸水解［14］。

4）16SrDNA序列測定與系統進化關系的分析：采用細菌總DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術有限公司），按照說明書提取菌株BO2基因組總DNA。采用細菌16SrDNA的通用引物16Sf 5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′16Sr 5′－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3′PCR 擴增16SrDNA。DNA 測序由上海美吉生物公司完成。將菌株BO2的16SrDNA序列（約1.5Kb）同GenBank數據庫中選取的與其親緣關系較近的菌株用BioEdit軟件的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment）進行序列比對，用DNA Star軟件進行序列相似性比較，系統發育分析采用Mega4.0軟件的鄰接法（Neighbor－joining method）進行［4］。

1.4 培養方法擴大培養

從2216E固體培養基平板上挑取一環BO2菌株，接種于50mL 2216E液體培養基內，30℃，200r／min（后續試驗均采用此搖床轉速）活化培養2d。取0.1mL菌液再次接種到50mL 2216E液體培養基內，同條件活化培養，作為后續試驗菌種。

發酵培養：以體積分數5%的接種量將活化后的菌種接種到發酵培養基中，30℃培養，進行后續試驗。

1.5 表面活性劑定性分析

脂肽定性分析參考文獻［15］。細菌脂肽表面活性劑多為環脂肽，經濃鹽酸水解后，N－端裸露，茚三酮染色呈陽性。脂肽的薄層層析法與脂肽檢測：菌株BO2于發酵培養基中，30℃培養36h后取3L發酵液，4℃、11 000r／min離心25min，取疏水層用3倍體積的正己烷除去未降解的烷烴，用氯仿∶甲醇＝1∶1等體積抽提3～4次，合并抽提液，40℃旋蒸濃縮（添加無水硫酸鈉除水）至2mL。用移液器點樣至已活化好的硅膠板上（德國Merck公司GF254TLC薄層層析硅膠板）。將硅膠板放入已飽和的層析缸中展開，取出硅膠板之后，待展層溶劑揮發干后于顯色劑下顯色［16－17］。TLC展開劑的體積比為氯仿∶甲醇∶水＝65∶15∶2，顯色劑為質量濃度2g·L－1的茚三酮水溶液。

1.6 生物表面活性劑定量分析

將菌株BO2菌種接種到發酵培養基中，30℃培養。0～48h內每隔4h取樣測定發酵液菌體生物量（OD600nm）以及發酵上清液的表面張力，繪制生長曲線及表面張力隨時間變化的曲線［18］。分析BO2生長曲線與表面張力的變化趨勢及相互關系，確定最適發酵時間。

將菌株BO2菌種接種到發酵培養基中，分別在21，24，27，30，33，36℃進行培養，定時取樣測定菌體生物量（OD600nm）以及發酵上清液的表面張力，確定最適發酵溫度。

表面張力的測定：采用環法JYW－200A自動界面張力儀測定表面張力［19］。

乳化性能的測定：取5mL柴油和5mL發酵上清混勻，超聲處理40s，在0～24h內測量乳化層和油相高度。乳化穩定值（EI24）＝ 乳化層高度（cm）／油相高度（cm）×100%［19－20］。

1.7 表面活性劑穩定性試驗

溫度處理：菌株BO2于發酵培養基培養36h后取5份發酵上清液，分別20，40，60，80，100℃水浴處理1h，測定表面張力和乳化系數。酸堿處理：菌株BO2于發酵培養基培養36h后取5份發酵上清液，用6mol·L－1的HCl溶液和1mol·L－1的NaOH溶液將其pH分別調為2，4，6，8，10，靜置10min，測定表面張力和乳化系數。鹽度處理：菌株BO2于發酵培養基培養36h后取5份發酵上清液，分別加入NaCl，使其NaCl質量濃度為30，60，90，120，150g·L－1，靜置10min，測定表面張力和乳化系數。

1.8 培養基的優化

以發酵上清液乳化系數為響應目標，采用Design Expert Version 7.0軟件，進行2步法進行優化。

1）Plackett－Burman實驗：Plackett－Burman實驗設計目的在于確定顯著因素。選取菌株BO2產表面活性劑培養基中的7個因素（胰蛋白胨、NH4NO3、液體石蠟、大豆油、FeSO4、MgSO4、KH2PO4）另加一個誘導因素（SrCl2）共8個因素作為變量，另設3個虛擬變量。每種待篩選因素設置一高一低兩個水平，分別用“＋”，“－”號表示，利用Design Expert軟件生成Plackett－Burman實驗表格進行試驗，各因素的表現水平見表1。在Plackett－Burman實驗中，各變量對于乳化系數影響大小的一元擬合等式：

式中，Y是預測的響應值，β0和βi是常量系數，χi是編碼的獨立因素。以發酵上清液乳化系數為響應值，選取可信度大于95%的因素作為響應面設計的變量，即對表面活性劑效果促進明顯的主要因素。

2）Box－Behnken響應面實驗：Box－Behnken響應面實驗設計用于優化培養基配方。根據Plackett－Bur－man實驗的篩選結果，取可信度為95%以上的顯著因素為變量；其他因素視為非顯著性因素，一律取其高低值的低值。利用Design Expert Version 7.0軟件生成Box－Behnken實驗表格進行試驗。仍以乳化系數為響應值，根據實驗結果進行數學建模分析，得出能使乳化系數達到最大值的培養基配方。并根據結果進行驗證實驗，確認Box－Behnken分析實驗的可靠性。

表1 Plackett－Burman設計中各因素變化水平Table 1 Levels of the variables of Plackett－Burman design

1.9 統計分析

所有實驗數據重復測定3次，結果為平均值±標準差。實驗數據用Excel 2003軟件進行單因素方差分析和顯著性差異分析。

2 結果與分析

圖1 BO2菌株的透射電鏡形態Fig.1 The transmission electron microscope photoraph of BO2

2.1 菌株形態及生理生化特性

1）形態：BO2菌株在2216E平板生長，菌落直徑2～3mm，白色不透明，表面粗糙，中央隆起，外型規則，邊緣平整，無暈圈。透射電鏡下菌體形態為細胞呈短桿狀，大小約為1.1μm×0.5 μm，無鞭毛，菌體邊緣平滑（圖1）。

2）生理生化鑒定：BO2菌株呈革蘭氏陽性，能形成芽孢，厭氧條件不生長，甲基紅試驗陽性，硝酸鹽還原試驗陽性，葡萄糖培養產酸不產氣，可液化明膠，水解淀粉，水解酪素。

3）rDNA系統發育樹：16SrDNA分子鑒定結果表明菌株BO2為芽孢桿菌屬（Bacillus），由系統發育樹可知BO2與Bacillus methylotrophicus的親緣關系最近（圖2），同源性98.63%。

2.2 表面活性劑的薄層層析鑒定結果

利用發酵培養基，30℃培養BO2菌株36h。發酵液4℃、11 000r／min離心25min除去菌體，取疏水層提取表面活性物質。該物質經TLC展層分離，直接用茚三酮進行染色，結果呈陰性；將薄層板放入裝有濃鹽酸的密封瓶內原位水解后，再用茚三酮染色，顯紅色斑點（圖3）。因此判斷，BO2表面活性劑是一種環狀脂肽類化合物。

圖2 基于菌株BO2和相關菌株16SrDNA構建的系統發育樹（鄰接法）Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the neighbor joining approach based on the 16SrDNAs of BO2and related strains

圖3 菌株BO2產表面活性劑薄層色譜（TLC）Fig.3 Thin－layer chromatography of the biosurfactant produced by strain BO2

2.3 生物表面活性劑產生與菌體生長之間的關聯

利用發酵培養基，30℃培養BO2菌株，結果顯示在對數生長期，發酵上清液的表面張力隨菌體生長而下降；20h時菌體生長進入穩定期，發酵上清液表面張力繼續下降；36h時表面張力降到最低值31.0mN／m，故取36h作為最適發酵時間（圖4）。

利用發酵培養基，以36h作為BO2菌株培養時間，試驗結果顯示30℃培養時發酵上清液表面張力值最低。故取30℃作為最適培養溫度（圖5）。

2.4 表面活性劑的理化穩定性

溫度影響實驗表明，溫度升高會使BO2菌株發酵上清液表面張力小幅度上升，處理溫度超過60℃后其乳化系數明顯下降，最適作用溫度在40℃左右（圖6）。

pH影響實驗結果表明，較高或較低的pH環境均會使BO2菌株發酵上清液表面張力小幅度升高，其最低點介于pH 6～8；環境pH在6以下時乳化系數急劇降低，這與脂肽的酸沉降性質相吻合，最適作用pH為8左右（圖7）。

NaCl質量濃度（g·L－1）實驗結果表明，BO2菌株發酵上清液表面張力隨NaCl質量濃度升高有小幅度波動，其最低點ρNaCl為30g·L－1；乳化系數隨NaCl質量濃度升高也有所波動，其最高點ρNaCl也為30g·L－1；整體上，菌株BO2所產脂肽類表面活性劑對不同NaCl質量濃度的適應性較好（圖8）。

2.5 表面活性劑培養基的優化

1）Plackett－Burman實驗：Plackett－Burman實驗設計及結果見表2，D1，D2，D3為3個虛擬變量。根據表2中的實驗結果，用軟件進行一次回歸分析，回歸方程：Y（%）＝40.19＋4.01×X1＋10.31×X2＋7.46×X3＋3.62×X4－2.83×X5－5.34×X6－12.13×X7－1.79×X8。各因素的主效應分析結果見表3，X2（NH4NO3）、X3（液體石蠟）、X7（KH2PO4）可信度均大于95%，為主要影響因素。模型的顯著性為96.29%（＞95%），說明模型對實驗結果有很好的解釋。

2）Box－Behnken優化試驗

以A（液體石蠟）、B（NH4NO3）、C（KH2PO4）作為自變量，其他非主要因素維持低水平。仍以乳化系數為響應值，采用三因素三水平的Box－Behnken響應面分析法進一步對培養基進行優化，實驗設計見表4，實驗結果見表5。

根據表5中的實驗結果，利用軟件的響應面回歸對其進行二次回歸分析，回歸方程：Y（%）＝63.80＋6.5×A－2.12×B＋1.63×C－1.75×A×B－1.75×A×C＋3.0×B×C－10.15×A2－11.40×B2－8.90×C2。

通過變異系數分析對二次方程的顯著性進行分析，結果見表6。

F值為4.77（＞4）說明該模型顯著，只有2.58%的機率模型不能擬合。P值為0.025 8（＜0.05）也說明模型顯著，A，A2，B2，C2是顯著的影響因子。模型擬合R2為0.859 8，說明該模型對實驗中85.98%的情況可以解釋，即模型預測與實驗擬合具有較好的一致性。

各因素的響應面及等高線（圖9～11）顯示，預測的乳化系數最大值在曲面頂點處。通過分析預測模型得出：A，B，C的最佳值分別為0.327，－0.11，0.04，與之對應的液體石蠟體積濃度為49.80mL·L－1，NH4NO3，KH2PO4的質量濃度分別為1.39，1.54g·L－1，其他成分為酵母粉0.7g·L－1、胰蛋白胨3g·L－1、大豆油20mL·L－1、FeSO40.14mg·L－1、MgSO40.25g·L－1、SrCl20.05g·L－1、天然海水1 000 mL，對應預測的乳化系數最大值為65%。以此條件進行驗證試驗得到菌株BO2發酵上清液乳化系數為67.3%，在原基礎上提高了14.3%，說明預測結果與實驗結論一致性較高，并證明了預測模型的可靠性。

表2 Plackett－Burman設計篩選對發酵液乳化系數有顯著影響的因素Table 2 Plackett－Burman design for screening of significant factors affecting EI24of the culture

表3 8個待選因素對于表面活性劑乳化系數的顯著性分析Table 3 The significance analysis of 8selected factors according to biosurfactant EI24

表4 Box－Behnken實驗因素與水平Table 4 Levels and factors tested in the Box－Behnken design

表5 Box－Behnken實驗設計表及實驗結果Table 5 Experiment design and results of the Box－Behnken design

表6 乳化系數二次響應模型的方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model for EI24

3 討 論

系統發育分析表明，菌株BO2與Bacillusmethylotrophicus有最近的親緣關系，目前未見報道B.methylotrophicus產生生物表面活性劑。大多生物表面活性劑由于產量較低、制備成本高導致應用受限，故直接應用發酵液為一種較可行的選擇。張明露等以一株芽孢桿菌的發酵液對石油烴進行乳化實驗，證明了此方法的可行性［21］。芽孢桿菌BO2菌株無需誘導就能利用簡單廉價的氮磷營養和石蠟，產生環狀脂肽類表面活性劑乳化石油，發酵2d后可使培養基表面張力由53.0mN·m－1降至31.0mN·m－1。研究中還發現，BO2菌株的表面活性劑適用于多種極端環境，包括高鹽（ρNaCl為150g·L－1）、堿性（pH10）、較高溫度（60℃），其乳化能力和降低溶液表面張力均有良好的表現，因此其適用范圍廣、耐受能力強，具有潛在的應用價值。

國內外一些研究應用RSM法優化產表面活性劑菌株的發酵培養基，劉佳等以菌體生長量為響應系數對一株產堿桿菌的培養基進行優化，證明石蠟、牛肉膏、K2HPO4／KH2PO4為顯著因素［22］。Sivapathasekaran等以表面活性劑粗提物為響應系數，對一株環狀芽孢桿菌的培養基進行優化，證明葡萄糖，尿素、SrCl2、MgSO4為顯著因素［23］。Chen等以表面活性劑粗提物產量為響應系數，對一株銅綠假單胞菌的培養基進行優化，MgSO4和FeSO4為顯著因素［24］。Mutalik等以表面活性劑粗提物產量為響應系數，利用RSM方法中的中心復合設計（CCRD）對一株銅綠假單胞菌的培養基進行優化，證明甘露糖醇、酵母粉、蛋白胨和十六烷為顯著因素［25］。以上試驗說明RSM法是一種可行的培養基優化試驗方法，也說明了影響不同菌株產表面活性劑的因素差異很大。然而菌體生長量以及表面活性劑粗提物作為乳化系數在反映表面活性劑實際效價上都有所偏差，未能真正體現實際應用中表面活性劑的作用效果。本研究采用RSM法的Box－Behnken設計，以發酵液乳化系數作為響應值來優化Bacillus菌屬產生物表面活性劑培養條件，可以直接準確反映發酵液（生物表面活性劑）的效價，確保了優化實驗的可靠性，結果表明，所選因素KH2PO4，NH4NO3對乳化能力的影響最大，其次是液體石蠟。因此，針對目前生物表面活性劑產量低，不易分離純化的問題，實際應用中，菌株BO2可利用簡單廉價的氮磷營養和石蠟發酵，并直接采用發酵上清液作為表面活性劑乳化石油，既可簡化操作，又能降低成本。

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