改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法在抗真菌藥物體外敏感性試驗中的應用研究

陳思敏，何巧，諶立巍

隨著時代的發(fā)展，嚴重的真菌感染逐漸增加。真菌感染、尤其是免疫力低下者機會性真菌感染發(fā)病率的不斷上升，使真菌的治療面臨嚴峻考驗。大量抗真菌藥物的面世，對臨床真菌感染性疾病的治療帶來了新的轉(zhuǎn)機，同時關于耐藥的報道也日益增多[1]。現(xiàn)階段，中醫(yī)藥現(xiàn)代化的高速發(fā)展，涌現(xiàn)了一批很有代表性的抗真菌中成藥及中藥有效成分，如何對這類藥物進行抗真菌體外敏感性評價，預測臨床抗菌療效就成為一個突出而迫切需要解決的問題。全世界多個實驗室多以美國國家臨床實驗室（CLSI，前NCCLS）推薦的M27-A[2]方案和M38-A，采用液體培養(yǎng)基稀釋法（包括試管法和微量法）對酵母菌和絲狀真菌[3]進行抗真菌藥物體外敏感性試驗，取得了較好的一致性和穩(wěn)定性。但是，對于中成藥或中藥提取物，其成分復雜，溶解性不理想，通過肉眼判斷真菌是否生長不準確。因此在方法學上需要找到一種和CLSI方案一致，又適用于中藥研究的體外敏感性試驗方法。本研究采用CLSI M27-A2推薦的微量液體培養(yǎng)基稀釋法和改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法同時測定20株臨床近期分離無重復白色念珠菌對伊曲康唑的體外敏感性，初步比較兩種方法的一致性，為建立實用性更強、直觀、簡便、快捷的抗真菌體外藥物敏感性試驗方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 臨床分離菌株 均為2012年7月～2012年8月從四川省內(nèi)三級甲等醫(yī)院住院患者體內(nèi)分離的無重復臨床致病白色念珠菌，標本主要由皮膚、生殖系統(tǒng)等感染病患者的分泌物臨床標本中分離。所有分離菌株經(jīng)分離單位鑒定，并含有一定比例耐藥菌株。1.1.2 標準質(zhì)控菌株 白色念珠菌ATCC 90029，平滑念珠菌ATCC 22019均由中國國家菌種庫購買。

1.2 供試藥物

伊曲康唑，批號：20111101，成都倍特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，由四川省醫(yī)藥有限公司提供。

1.3 試驗試劑

RPMI-1640液體培養(yǎng)基（GIBCO公司生產(chǎn)，批號31800-022），沙氏培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司生產(chǎn)，批號20120818），固體瓊脂粉（成都市科龍化工試劑廠，批號20120301），葡萄糖（成都市科龍化工試劑廠，批號20120331）。

1.4 方法

1.4.1 液體培養(yǎng)基稀釋法（微量法）受試菌液的配制 所有受試菌株，均由甘油保存于－20℃。實驗前接種于改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基平皿上復蘇，于35℃培養(yǎng)7天后，傳代一次受試。取新鮮沙氏培養(yǎng)基上的單一菌落3～5個，用5mL生理鹽水配置為0.5麥氏濃度（1～5×106CFU﹒mL-1），并用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋1000倍為1～5×103CFU﹒mL-1菌懸液備用。受試藥物配制 采用培養(yǎng)基對倍稀釋方案，將藥物伊曲康唑溶于RPMI-1640液體培養(yǎng)基中，對倍稀釋，使伊曲康唑終濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。加藥方案 將受試藥液按濃度差異分別加入U形96孔板中，每孔加入100 μL藥液。而后加藥孔菌加入對應20株不同菌種的100 μL菌懸液，使每孔菌濃度均保持在0.5～2.5×103CFU﹒mL-1。試驗結(jié)果判定 96孔板于35℃ 孵育培養(yǎng)48 h后，與空白對照組進行比較，以肉眼澄清為標準，以溶液澄清的最低藥物劑量為該藥物對該受試菌的最小抑菌濃度MIC值。質(zhì)控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟隨每批實驗。

1.4.2 改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法

1.4.2.1 受試菌液的配制同液體培養(yǎng)基稀釋法項下加藥方案及結(jié)果判定 將伊曲康唑用無菌水倍比稀釋為10個濃度，分別精密量取1mL藥液與加熱溶解的14mL含2%葡萄糖的RPMI-1640固體培養(yǎng)基（每L培養(yǎng)基中已經(jīng)加入消毒滅菌的12.5 g固體瓊脂粉，并充分溶解）充分混合，加入到90 mm的一次性消毒培養(yǎng)皿中，保持培養(yǎng)皿中所含抗菌藥的最終稀釋濃度為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 μg﹒mL-1。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，吸取20株菌株的菌懸液5 μL分別接種于含藥培養(yǎng)皿中，35℃條件下于孵箱中培養(yǎng)48小時，以肉眼未見真菌菌團生長的最低藥物濃度為 MIC。質(zhì)控菌白色念珠菌ATCC 90029、平滑念珠菌ATCC 22019跟隨每批實驗。

1.5 數(shù)據(jù)分析

記錄每一株真菌的MIC值，以50%真菌MIC值為MIC50，以90%真菌MIC值為MIC90，以最小MIC值與最大MIC值之間的范圍為MIC range，并比較兩種試驗方法下，20株白色念珠菌對伊曲康唑敏感性的差異。

2 結(jié)果

兩種體外抗真菌敏感性試驗結(jié)果見表1。

表1 兩種體外抗真菌敏感性試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，兩種方法所測得的MIC具有一致性。

3 討論

隨著社會的發(fā)展以及醫(yī)療水平的提高，移植、腫瘤和免疫缺陷患者的增多，侵襲性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明顯增加。近年來有多種新型抗真菌藥物投入臨床，臨床真菌耐藥性也隨之出現(xiàn)。現(xiàn)已有報道，有多種中藥及提取物具有抗真菌的作用[4]。說明中藥抗真菌藥物的研發(fā)具有很大的優(yōu)勢和潛力。但是由于中藥單體或復方的特殊性，如成分復雜、溶解度差，并且往往帶有較深的顏色，所以傳統(tǒng)的抗真菌藥物敏感性試驗方法和標準已難以滿足中藥抗真菌藥物的研究。本試驗就是在原有的抗真菌試驗基礎上進行改良，采用固體培養(yǎng)基進行試驗。此種方法不但可以在短期內(nèi)通過觀測可視菌落的生長判定藥物的MIC值，同時還避免了由于藥物本身原因造成的肉眼MIC值判定的誤差，具有實用性。本試驗以常用抗真菌藥伊曲康唑為載體，采用兩種方法觀測其近期臨床分離白色念珠菌的藥物敏感性，兩種方法所得結(jié)果具有一致性，結(jié)果初步顯示改良瓊脂培養(yǎng)基稀釋法有可能成為一種評價抗真菌藥物體外敏感性的一種直觀、簡單、快速的方法。

[1] 劉錦燕.抗真菌藥物敏感性試驗方法研究進展[J].檢驗醫(yī)學,2009,24(12):927.

[2] National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997:1.

[3] 李厚敏,劉偉,李若瑜.美國臨床實驗室標準化委員會2003年版產(chǎn)孢絲狀真菌藥敏試驗方案簡介[J].中華檢驗醫(yī)學雜志,2005,28(1):121.

[4] 王剛生,鄧潔華.桂皮油藿香油復合物對曲霉菌活性及機理的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,23(6):1426.