山茱萸疏松愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究

付廣俊，王敏麗，劉 梅，龍 艷

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036）

山茱萸為茱萸科茱萸屬多年生木本植物，主要以果實(shí)入藥，俗稱(chēng)山茱萸，又名山芋肉、藥棗、實(shí)棗兒、棗皮、肉棗等，系名貴大宗藥材[1]。山茱萸其性味酸，澀，微溫，入肝腎兩經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫之功效，是中醫(yī)臨床中常用的一味藥。山茱萸作為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，具有多種化學(xué)成分和藥理作用，故具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。據(jù)化學(xué)分析，山茱萸含有生理活性較強(qiáng)的山茱萸甙、酒石酸、沒(méi)食子酸、蘋(píng)果酸、樹(shù)酯、鞣質(zhì)和多種維生素等有效成分，具有抗菌消炎，降血脂，降血糖，抗癌，抗衰老，提高免疫力等作用[2-4]。

為了充分有效地利用山茱萸資源，筆者以山茱萸葉片、莖段、種子胚等作為外植體進(jìn)行了誘導(dǎo)試驗(yàn)，篩選出生長(zhǎng)迅速且質(zhì)地疏松的誘導(dǎo)愈傷組織，并進(jìn)行了繼代培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)化試驗(yàn)條件，旨在獲得最佳的繼代培養(yǎng)方法，為山茱萸的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為山茱萸的幼嫩葉片、莖段、種子、成熟葉片等，采自于安徽省池州市石臺(tái)縣山茱萸生產(chǎn)基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理 選取無(wú)病蟲(chóng)害山茱萸的嫩葉、莖段和莖尖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，先用洗滌劑洗去表面灰塵，再用流水沖洗2 h。清洗后的材料在無(wú)菌的條件下，用0.1%HgCl2結(jié)合使用75%酒精進(jìn)行不同時(shí)間的消毒處理[5]。放入75%酒精中消毒10~20 s，無(wú)菌水沖洗2~3遍，再放入0.1%HgCl2中消毒7~9 min，用無(wú)菌水沖洗5~6次。滅菌紙吸干水后接種在各種培養(yǎng)基上。種子先用75%酒精浸泡1 min，用0.1%HgCl2消毒5~6 min，再用無(wú)菌水沖洗3遍，切取種子中的胚接入無(wú)菌培養(yǎng)基上[6]，觀察并記錄培養(yǎng)狀況。

1.2.2 培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂 7 g/L，pH 值為 5.6～6.0，以及不同濃度的激素 2，4-D，KT。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d 。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 將消毒處理后的無(wú)菌幼嫩葉片、老葉片、莖段作為外植體，其中葉片切成0.4 cm×0.4 cm的小塊、莖段切成1 cm左右的小段，然后將不同的外植體接種于MS+2，4-D（1 mg/L）+KT（3 mg/L）培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究。每個(gè)處理20塊左右，重復(fù)3次，25 d后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。1.2.4 愈傷組織繼代培養(yǎng) 選擇質(zhì)地均勻疏松度好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，把愈傷組織接種于不同條件的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)一般5次以上，即可得到均勻、疏松、狀態(tài)穩(wěn)定的愈傷組織。每瓶愈傷組織接種量1 g左右，每組處理15瓶，重復(fù)3次。觀察愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)、顏色以及疏松度等狀況，計(jì)算其生長(zhǎng)率。

1.2.5 誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)考核指標(biāo) 生長(zhǎng)率（%）=（收獲細(xì)胞量-接種細(xì)胞量）/接種細(xì)胞量×100%；死亡率（%）=（死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100% ；污染率（%）=（污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%；愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（形成愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 山茱萸愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 不同激素濃度對(duì)山茱萸外植體的誘導(dǎo)效應(yīng)將山茱萸嫩葉、老葉、莖段、無(wú)菌苗等接種到添加了不同組合濃度的KT+2，4-D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，接種外植體個(gè)數(shù)均為60，結(jié)果如表1所示。

表1 不同KT+2，4-D濃度對(duì)山茱萸葉片、莖段、無(wú)菌苗愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

KT+2，4-D的組合均可以不同程度地誘導(dǎo)愈傷組織形成，KT（3 mg/L）+2，4-D（1 mg/L）組合對(duì)山茱萸的誘導(dǎo)效果最好，最高誘導(dǎo)率達(dá)80%以上。如圖1所示，嫩葉片產(chǎn)生的愈傷組織較疏松，顏色淺，不易分化，這種愈傷組織在培養(yǎng)過(guò)程中，要及時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，否則容易轉(zhuǎn)變成灰褐色，產(chǎn)生褐變，直至死亡；莖段產(chǎn)生的愈傷組織一般比較堅(jiān)實(shí)致密，繼代培養(yǎng)過(guò)程中，顏色逐漸變?yōu)榘咨?，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)緊密，不易褐變；老葉片愈傷組織顏色呈淺黃色，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)緊密，易褐變；無(wú)菌苗葉片愈傷組織顏色呈淡黃色，愈傷組織疏松易碎，繼代培養(yǎng)中易褐變。無(wú)菌苗與老葉片不適合做繼代培養(yǎng)，嫩葉片和莖段的愈傷組織都適合繼代培養(yǎng)。

圖1 山茱萸愈傷組織

2.1.2 消毒處理對(duì)外植體的污染控制比較 污染是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中由于微生物的存在，使培養(yǎng)物生長(zhǎng)受到影響或死亡的現(xiàn)象，所以控制污染是組培中的首要技術(shù)[7]。植物本身帶菌是造成組織污染的關(guān)鍵因素，山茱萸外植體所帶菌不易清涂，對(duì)山茱萸初代培養(yǎng)的影響巨大。采用0.1%的HgCl2和75%的酒精聯(lián)合消毒，比較了不同消毒時(shí)間對(duì)污染控制的影響，接種數(shù)均為30，結(jié)果如表2所示。

表2 消毒處理對(duì)山茱萸不同外植體消毒效果的影響

由表2可知：接種1周后觀察發(fā)現(xiàn)，以0.1%HgCl2消毒5 min的材料污染情況很?chē)?yán)重，以75%乙醇消毒10 s和0.1%HgCl2消毒7 min時(shí)，材料污染較小。 將75%乙醇、0.1%HgCl2的消毒時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，污染率顯著下降，當(dāng)以75%乙醇消毒20 s和0.1%HgCl2消毒11 min時(shí)，污染率變?yōu)?。但隨著殺毒時(shí)間的延長(zhǎng)，材料的死亡率大幅提高。綜合考慮以上因素，認(rèn)為0.1%HgCl2消毒9 min和75%乙醇消毒15 s為較理想的消毒處理時(shí)間，經(jīng)過(guò)消毒處理，培養(yǎng)過(guò)程中褐化程度、污染率以及死亡率都較低，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.1.3 光照條件對(duì)山茱萸葉片形成愈傷組織的影響 在相同的培養(yǎng)基中，不同光照條件下的愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織的性狀都有明顯的差異。以山茱萸葉片為外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將其中的一部分置于光照下（光照時(shí)間為12 h/d），而將另一部分放在黑暗中培養(yǎng)，接種外植體數(shù)均為30，接種第25天后其愈傷組織的生長(zhǎng)情況如表3所示。

表3 光照條件對(duì)山茱萸葉片形成愈傷組織的影響

愈傷組織好的標(biāo)準(zhǔn)是生長(zhǎng)快，顏色淺，愈傷疏松易生長(zhǎng)，不易褐變。從表3可以看出，光照條件對(duì)山茱萸葉片愈傷組織形成的遲早、性狀和出愈率等方面有很大的影響。據(jù)試驗(yàn)觀察，暗培養(yǎng)下外植體黃化嚴(yán)重，葉片易褐變，愈傷組織生長(zhǎng)速度慢，性狀一般。在光照培養(yǎng)下的愈傷組織顏色為淺白色，生長(zhǎng)快，高度分散，性狀好。因此，光照培養(yǎng)更有利于山茱萸疏松愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2 山茱萸愈傷組織的繼代培養(yǎng)

2.2.1 接種量對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響 在其他條件不變的情況下，選擇不同接種量的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)后愈傷組織的生長(zhǎng)率來(lái)確定最佳的接種量。當(dāng)平均接種量分別為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/瓶時(shí)，接種20 d后的平均重量分別為0.95、1.29、1.65、1.96、2.19 g/瓶，平均生長(zhǎng)率分別為 58.3%、61.3%、65.0%、63.3%、56.4%。由此可見(jiàn)，接種量過(guò)大或過(guò)小都不利于愈傷組織的生長(zhǎng)。當(dāng)接種量為1.0 g/瓶時(shí)，愈傷組織平均生長(zhǎng)率最高。接種量過(guò)大時(shí)，重量增加但生長(zhǎng)率反而減少，這是由于部分細(xì)胞吸收不到營(yíng)養(yǎng)，培養(yǎng)后期愈傷組織易老化褐變所致。因此，愈傷組織的適宜接種量在1.0 g/瓶左右。

2.2.2 不同pH值對(duì)愈傷組織繼代生長(zhǎng)的影響在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，選擇不同pH值的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，根據(jù)接種20 d后的重量來(lái)選擇最適pH值。當(dāng)pH值分別為5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，接種量為1.0 g/瓶，接種20 d后的重量分別為1.18、1.45、1.76、1.48、1.31 g/瓶。研究結(jié)果表明：初始pH值偏高或偏低都不利于愈傷組織的生長(zhǎng)。當(dāng)pH值小于5.6時(shí)，培養(yǎng)基無(wú)法很好的凝固，水分含量大，接入的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，容易褐變死亡。當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，培養(yǎng)基較硬，接入的愈傷組織很難固定，容易松動(dòng)，難以從培養(yǎng)基中吸收營(yíng)養(yǎng)，這樣也會(huì)造成愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，愈傷組織缺乏營(yíng)養(yǎng)，顏色逐漸變黃，甚至褐變死亡。當(dāng)pH值為5.6～6.0時(shí)，以pH 5.8為最佳，培養(yǎng)基軟硬適中、質(zhì)地良好，接種愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)好，易得到疏松而生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。

2.2.3 光照條件對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)狀況的影響 以山茱萸葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)狀態(tài)較為一致的疏松愈傷組織為材料，一組在12 h/d的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；另一組于25℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。當(dāng)接種天數(shù)分別為 1、5、10、15、20、25、30、35 d 時(shí)，光照條件下山茱萸愈傷組織的重量分別為0.60、0.64、0.73、0.85、0.95、1.02、1.06、1.03 g/瓶，暗培養(yǎng)條件下山茱萸愈傷組織的重量分別為 0.60、0.62、0.68、0.77、0.86、0.92、0.89、0.82 g/瓶。山茱萸愈傷組織在光照條件下，35 d后進(jìn)入衰亡期，而在黑暗中30 d后就進(jìn)入了衰亡期。觀察細(xì)胞的狀態(tài)后發(fā)現(xiàn)，光照下產(chǎn)生的愈傷組織隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞的顏色變化不大，生長(zhǎng)狀態(tài)也較好，而暗培養(yǎng)下的愈傷組織太疏松，時(shí)間稍長(zhǎng)，褐變情況越來(lái)越嚴(yán)重。在光照條件下不同時(shí)間的生長(zhǎng)量都要大于在黑暗條件下的生長(zhǎng)量。由此可見(jiàn)，光照條件有利于愈傷組織的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

研究分別選擇了嫩葉、老葉、莖段、無(wú)菌苗作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)嫩葉、莖段、無(wú)菌苗都是較適宜的培養(yǎng)材料，其中以嫩葉、莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的形成，誘導(dǎo)率可達(dá)80%以上，愈傷形成的時(shí)間也相對(duì)較短；而以老葉為外植體，誘導(dǎo)率最差，只有40%左右，形成愈傷組織時(shí)擇在光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，3%蔗糖，pH值為5.8左右時(shí)對(duì)嫩葉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，誘導(dǎo)效果最好。繼代培養(yǎng)以pH值為5.8，接種量1g/瓶，在12 h/d的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得的愈傷組織最適宜做懸浮培養(yǎng)。

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