鰱魚(yú)蛋白質(zhì)酶水解最佳工藝條件的研究

劉永樂(lè)，李向紅，陳志軍，王發(fā)祥，王建輝，俞 健

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410014）

我國(guó)是淡水資源大國(guó)，淡水魚(yú)產(chǎn)量一直居世界前位。湖南省是水產(chǎn)大省，全省有水面136.2萬(wàn)hm2，內(nèi)陸水域面積居全國(guó)第3位，2008年全省水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到207.3萬(wàn)t，淡水魚(yú)產(chǎn)量排全國(guó)第4位，漁業(yè)總產(chǎn)值162.9億元，占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的6.7%，淡水魚(yú)是僅次于水稻和生豬的大宗農(nóng)產(chǎn)品。但目前湖南省漁業(yè)產(chǎn)業(yè)狀況仍不容樂(lè)觀，鰱魚(yú)、草魚(yú)、鳙魚(yú)等較低價(jià)值魚(yú)類(lèi)基本上只能鮮銷(xiāo)[1]，鮮銷(xiāo)過(guò)程中腐敗率達(dá)30%以上，易導(dǎo)致漁農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入減少、資源浪費(fèi)和環(huán)境污染；水產(chǎn)品加工率低，發(fā)達(dá)國(guó)家的水產(chǎn)品加工率在80%以上，我國(guó)淡水魚(yú)加工率僅5%左右，而湖南省則不足3%；而且加工深度不夠，初級(jí)加工產(chǎn)品依然統(tǒng)領(lǐng)市場(chǎng)，缺少優(yōu)質(zhì)定型產(chǎn)品。因此，研發(fā)低值淡水魚(yú)的綜合利用技術(shù)，提高產(chǎn)品附加值勢(shì)在必行。

目前，魚(yú)類(lèi)水解蛋白因其氨基酸比值與人體肌肉成分近似，而受到人們的普遍關(guān)注，酶解后的小分子多肽容易被人體消化吸收，經(jīng)過(guò)加工后，魚(yú)產(chǎn)品的功能和價(jià)值也得到較大的提升[2-5]。當(dāng)前，人們已經(jīng)開(kāi)始研究低值小雜魚(yú)及魚(yú)雜的酶解條件[6-7]。鰱魚(yú)作為我國(guó)四大家魚(yú)之一，具有生長(zhǎng)快、質(zhì)量大、細(xì)刺少等特點(diǎn)，且飼料來(lái)源廣泛，大規(guī)模養(yǎng)殖產(chǎn)量最高。但其肉質(zhì)有些粗糙，口感欠佳，鮮食不太受歡迎。鰱魚(yú)的蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)到26.6%，同時(shí)含有豐富的不飽和脂肪酸，有利于血液循環(huán)，經(jīng)常食用具有抗衰老、養(yǎng)顏的功效，對(duì)腫瘤也有一定的預(yù)防作用[8-11]，因此，鰱魚(yú)是水解魚(yú)肉蛋白的佳選。試驗(yàn)以鰱魚(yú)為原料，采用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解，對(duì)其水解工藝的優(yōu)化進(jìn)行了探索，旨在為提高鰱魚(yú)這種低值淡水魚(yú)的綜合價(jià)值提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚(yú)蛋白（實(shí)驗(yàn)室自制）；復(fù)合蛋白酶、TNBS試劑（Sigma公司）；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（上海澤龍生物工程有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-2100型，上海舜宇恒平）；pH計(jì)（DELTA 320，上海天普pH計(jì)有限公司）；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（天津市泰斯特儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（RC-6 Plus，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；定時(shí)恒溫磁力攪拌器（90-2型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；高速組織搗碎機(jī)（武漢市江漢區(qū)圣科儀器設(shè)備批發(fā)部）；島津電子分析天平（AUY120，日本島津公司）；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)成分的測(cè)定 蛋白質(zhì)的測(cè)定：凱氏定氮法 GB5511-85，N 為 7.24[12]；水分的測(cè)定：105℃恒重法GB5512-85；灰分的測(cè)定：干法灰化法GB5505-85。

1.3.2 酸溶堿沉法提取魚(yú)蛋白的工藝流程 根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]采用酸溶堿沉法制備。

稱(chēng)取一定量的魚(yú)肉絞碎，固液比1∶9加水?dāng)嚢柽M(jìn)組織搗碎機(jī)以10 000 r/min搗碎打漿，然后用紗布過(guò)濾。濾液在4℃下用酸調(diào)節(jié)ph值至2.40并不斷攪拌90 min；5 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，將pH值調(diào)至5.40，再次5 000 r/min冷凍離心，得到的沉淀即為提取的粗蛋白，最后將粗蛋白冷凍干燥48小時(shí)得到蛋白粉備用。

制備魚(yú)蛋白主要工藝流程如下所示：魚(yú)肉切碎→加水打漿→加酸攪拌均質(zhì)→離心分離→上清液→堿沉→離心分離→沉淀→ 冷凍干燥→魚(yú)肉蛋白。

1.3.3 魚(yú)肉蛋白得率及提取率計(jì)算

1.3.4 鰱魚(yú)蛋白酶解物的制備 按如下流程制備可溶性魚(yú)蛋白質(zhì)[16]：

鰱魚(yú)蛋白→復(fù)合蛋白酶酶解（底物濃度3%、溫度55℃、pH值7.0、時(shí)間50 min、酶濃度1%）→滅酶（100℃，10 min）→ 離心（5 000 r/min，20 min）→上清液→濃縮→冷凍干燥→可溶性魚(yú)蛋白（魚(yú)肽）

2 結(jié)果與分析

2.1 原料鰱魚(yú)蛋白的基本成分

采用酸溶、等電沉降法提取鰱魚(yú)蛋白，所制備的鰱魚(yú)蛋白的基本組成：蛋白含量為75.24%，水分3.85%，灰分3.55，得率69.07%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

利用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白制作蛋白質(zhì)濃度與吸光值對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即可根據(jù)特定吸光值計(jì)算初出樣品液的蛋白質(zhì)濃度，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式為：y=0.943 x，R2=0.998。

2.3 酶解單因素試驗(yàn)

以底物濃度（%）、反應(yīng)時(shí)間（t，min）、反應(yīng)溫度（T，℃）和反應(yīng)pH值為單因素，以水解液中蛋白濃度為指標(biāo)分別進(jìn)行考察。

2.3.1 底物濃度對(duì)酶解結(jié)果的影響 配制底物濃度分別為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的蛋白溶液，按 0.1%（E/S）加入酶液，在溫度 55℃，pH 5.5下反應(yīng)55 min，升溫至90℃加熱10 min終止反應(yīng)，測(cè)定水解液蛋白濃度，結(jié)果如圖1所示。隨著底物濃度增加酶解液中蛋白濃度逐步增大，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊?%后變化趨于平緩，可能是由于底物濃度過(guò)大出現(xiàn)產(chǎn)物抑制，故選定2%為最適底物濃度。

圖1 底物濃度對(duì)酶水解鰱魚(yú)蛋白的影響

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解結(jié)果的影響 濃度為2%的蛋白液等量分成7份，在溫度55℃，pH值5.5下按0.1%（E/S）加入酶液反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間分別為15、25、35、45、55、65、75 min，結(jié)果如圖 2 所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物濃度一直在逐漸增大，但在55 min之后增加趨勢(shì)不再明顯趨于平緩，從經(jīng)濟(jì)性的角度考慮，最后確定55 min為最佳的反應(yīng)時(shí)間。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶水解鰱魚(yú)蛋白的影響

2.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶解結(jié)果的影響 在考察最適反應(yīng)溫度的時(shí)候其他的條件分別固定為：反應(yīng)時(shí)間為20 min，pH值為5.5，底物濃度1%。由圖3可以看出從30℃到60℃反應(yīng)上清液中的蛋白濃度先增加后降低，可見(jiàn)復(fù)合蛋白酶在催化魚(yú)蛋白水解過(guò)程中隨著反應(yīng)溫度的上升活性逐漸增大，增加到一定值后又開(kāi)始下降是因?yàn)槊敢彩且环N蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其變性，從而酶活力下降。由于在55℃出現(xiàn)濃度的峰值，說(shuō)明該酶的最佳反應(yīng)溫度為55℃。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酶水解鰱魚(yú)蛋白的影響

2.3.4 不同pH值對(duì)水解液蛋白質(zhì)濃度的影響在考察最適反應(yīng)pH值時(shí)，其他的條件分別固定為：反應(yīng)溫度為55℃、底物濃度1%、反應(yīng)時(shí)間55 min。從圖4可看出，pH值對(duì)復(fù)合蛋白酶水解鰱魚(yú)蛋白影響較顯著，在pH值逐步增大的過(guò)程中酶解液中蛋白濃度先增大，在pH值7.0時(shí)達(dá)到最大值，后又迅速下降。故確定pH值7.0為適宜pH值。

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)酶水解鰱魚(yú)蛋白的影響

2.4 魚(yú)蛋白水解條件的正交優(yōu)化法

為了獲得具有較高可溶性氮回收率的魚(yú)蛋白水解物，在單因素的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液pH值和底物濃度對(duì)水解液可溶性氮回收率（Recovery）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平來(lái)擬合因素和指標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系，采用正交分析法來(lái)尋求接枝最優(yōu)工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素的水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

從極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)水解液蛋白質(zhì)濃度影響的主次順序?yàn)椋篊>A>B>D，即pH值>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>底物濃度。最優(yōu)方案為C2A3B3D3。即魚(yú)蛋白水解的最佳工藝參數(shù)為pH值7.0、反應(yīng)溫度55℃、底物濃度3%、反應(yīng)時(shí)間為55 min。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.5 最佳提取工藝的驗(yàn)證

稱(chēng)取魚(yú)蛋白粉1.2 g（已經(jīng)按照純度將其折合成純蛋白，能夠達(dá)到所需濃度），加pH值7.0的磷酸鹽緩沖液15 mL，后待其加熱到55℃后加入0.5 mL 1%的復(fù)合蛋白酶溶液，反應(yīng)55 min進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果如表3所示。

表3 最佳酶解工藝驗(yàn)證結(jié)果 （%）

3 結(jié) 論

采用酸溶堿沉法提取魚(yú)蛋白，經(jīng)測(cè)定，蛋白質(zhì)含量約為75%。以蛋白質(zhì)水解液的蛋白質(zhì)回收率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定了魚(yú)蛋白水解的較佳工藝條件，并在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上用正交法對(duì)酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)時(shí)間為55 min，pH值為7.0，底物濃度為3%；優(yōu)化后的水解液蛋白質(zhì)回收率約為50.88%。水解后鰱魚(yú)蛋白在廣泛的pH值的范圍內(nèi)均有較好的溶解度，其他功能性質(zhì)也得到不同程度的提高。

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