不帶電荷極性氨基酸對兔肝中堿性磷酸酶活性的影響

張艷英，關學敏

(河北科技師范學院動物科技學院，河北省預防獸醫學重點實驗室，河北秦皇島，066600)

堿性磷酸酶(alkalinity phosphoric簡稱AP)是一種能催化多種磷酸脂類化合物并能水解釋放無機磷的酶，廣泛存在于動物血液和各種器官內，在骨骼形成以及脂肪合成過程中起重要作用，己作為動物生理活動和疾病診斷的一項重要指標［1］，如當雞發生佝僂癥時血清的堿性磷酸酶活性異常升高［2］。它還是一種底物專一性較低的磷酸單脂酶，在生物體內直接參與了磷酸基團的轉移和代謝過程，維持體內適宜的鈣磷比例，并且在脊椎動物的骨化過程中發揮了重要作用［3，4］。為了滿足生產實踐上的需要，國內以雞組織為材料來分離純化AP并對其性質進行分析的研究工作即已有很多［5，6］，筆者在此基礎上進一步研究幾種不帶電荷極性氨基酸對兔肝中AP活性的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及試劑

1．1．1 試驗器材 冷凍離心機(型號GL-20G-Ⅱ，購自上海安亭科學儀器廠)，722分光光度計(型號ST-20606010601，購自上海精密儀器有限公司)。

1．1．2 試驗試劑及其配制 新鮮兔肝(河北科技師范學院動物科技學院試驗室提供)，0．5 mol/L醋酸鎂溶液，0．1 mol/L 醋酸鈉溶液，0．01 mol/L 醋酸鎂-0．01 mol/L 醋酸鈉溶液，Tris-HCl pH 8．8 緩沖液，酚標準溶液，40 mmol/L底物溶液，酶液:D管稀釋5倍，0．5 mol/L氫氧化鈉溶液，質量濃度為3 g/L的4-氨基安替比林(AAP)溶液，質量濃度為5 g/L的鐵氰化鉀溶液，Folin-酚試劑甲，Folin-酚試劑乙，10 mmol/L的甘氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和絲氨酸。

標準蛋白質溶液:取結晶牛血清白蛋白溶于蒸餾水，質量濃度為250 mg/L。

1．2 試驗方法

1．2．1 AP的分離純化 按照生物化學中的有機溶劑分級沉淀法進行。以下操作均在4～10℃進行。

①稱取新鮮兔肝(清除結締組織)2 g，剪碎后，置于玻璃勻漿器中，加入2．0 mL 0．01 mol/L醋酸鎂-0．01 mol/L醋酸鈉溶液，充分磨成勻漿后，將勻漿液轉移到離心管中，用4．0 mL上述溶液分2次沖洗勻漿管，并倒入離心管中，混勻，加2．0 mL正丁醇，用玻璃棒充分攪拌約2 min，然后在室內放置20 min后，濾紙過濾，濾液置離心管中，于濾液中加入等體積冷丙酮，立即混勻后離心5 min(2 000 r/min)，棄上清液，向沉淀中加入4．0 mL 0．5 mol/L醋酸鎂溶液，用玻璃棒充分攪拌使其溶解。

②量懸液體積，并計算使乙醇終體積分數至0．30需要加入的體積分數為0．95冰乙醇的量。按計算量加入乙醇，混勻，立即離心5 min(2 000 r/min)，量取上清液體積，倒入另一離心管中，棄去沉淀。向上清液中加入體積分數為0．95的冰乙醇，使乙醇終體積分數達0．60，混勻后立即離心5 min(2 500 r/min)，棄上清液。向沉淀中加入4．0 mL 0．01 mol/L醋酸鎂-0．01 mol/L醋酸鈉溶液，充分攪拌，使其溶解。

③重復②操作，向懸浮液中加入冷乙醇(體積分數為0．95)，使乙醇終體積分數達0．30，混勻后立即離心5 min(2 000 r/min)，計算上清液體積，倒入另一離心管中，棄去沉淀，向上清液中加入體積分數為0．95的冷乙醇，使乙醇終體積分數達0．60，混勻后立即離心5 min(2 500 r/min)，棄上清液，沉淀用3．0 mL 0．5 mol/L醋酸鎂充分溶解，記錄體積，此為C1液。吸取C1液0．2 mL置于編號為C1的試管中，加入3．8 mL Tris緩沖液(pH 8．8)，供測酶活性用。

④向上述剩余懸浮液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮終體積分數達0．33，混勻后離心5 min(2 000 r/min)，棄去沉淀。量取上清液體積后轉移至另一離心管中，再緩緩加入冷丙酮，使丙酮終體積分數達到0．50，混勻后立即離心5 min(4 000 r/min)棄上清液，沉淀為部分純化的AP。像此沉淀中加入4．0 mL Tris pH 8．8緩沖液使沉淀溶解，再離心5 min(2 000 r/min)將上清液倒入試管中，記錄體積，棄去沉淀。上清液即為部分純化的酶液，此為D1液。吸取0．2 mL D1液置于編號為D1的試管中，加入0．8 mL Tris緩沖液(pH 8．8)，供測酶活性用。

⑤再稱取另一只兔的新鮮兔肝2 g，進行以上①～④的步驟，得到C2，D2液，供測酶活性用。

1．2．2 AP的活性測定 按照金氏法進行，并做適當改進。

取6支試管，按表1進行。

充分搖勻，室溫放置10 min，于波長510 nm處比色測定。以下式計算每毫升酶液的酶活性單位數。

酶活性單位數=(樣品OD510/對照OD510)×酚標準溶液的質量濃度×1/(0．1×稀釋倍數)

其中，酶活性單位數的單位:mL;酚標準溶液的質量濃度的單位:g/L。

表1 AP的活性測定 mL

1．2．3 AP的含量測定及比活性計算 按Folin-酚法進行，并做適當的改進。

①標準曲線的繪制 當加入Folin-酚試劑乙時，邊加邊搖，迅速混勻，室溫下放置30 min，以1號管為空白對照(表2)，于650 nm處比色。記錄數據，以標準蛋白含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。

表2 標準曲線的繪制

②樣品測定 于2支潔凈干燥的試管中，分別加入待測樣品各1 mL，加試劑甲、乙及比色操作步驟與①方法相同。

由待測樣品所得OD值，查標準曲線，求得AP含量，再乘以稀釋倍數，即可獲得樣品的AP含量。

③比活性計算

AP的比活性=每毫升樣品AP活性單位數/每毫升樣品蛋白質質量(mg)

1．2．4 AP的最適溫度的測定 調節恒溫水浴鍋，設置不同溫度，按上述方法測定酶活力后求出最適溫度。

1．2．5 AP的最適pH值的測定 在最適溫度(上一步已測出)條件下，在Tris-醋酸緩沖液的不同pH值下，按上述方法測定酶活力及比活力后求出最適pH值。

圖1 標準蛋白與OD值的標準曲線

1．2．6 不帶電荷極性氨基酸對AP活性的影響 在反應體系中分別測定相同濃度(10 mmol/L)下甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺對AP的影響，按上述酶活性的測定方法分別測定其活性。

2 試驗結果

2．1 AP 的含量

2．1．1 蛋白濃度標準曲線 由表2數據根據試驗方法1．2．3部分中的表2和1．2．3部分中的步驟②計算得出數據并繪圖(圖1)。

2．1．2 樣品中AP含量的測定 根據圖1所得蛋白的質量濃度標準曲線計算得出樣品蛋白的質量濃度(表3)。

表3 樣品蛋白的質量濃度

2．2 AP的最適溫度

根據試驗方法中 1．2．2 和 1．2．3 的步驟③，得到各個溫度下的AP活力及比活力(表4)。由表4作圖2。

表4 溫度與酶活力的關系

從圖表中可以看出，當溫度升高或降低時酶的活性也隨之變化，AP的最適溫度是39℃，而兔子的正常體溫在38．5～39．5℃之間，試驗結果也在其范圍之內。但是試驗中存在一定誤差，所以圖像不是規則的拋物線。

2．3 AP的最適pH值

在最適溫度下根據試驗方法1．2．5和1．2．3的步驟③，得到各個pH值下的AP活力及比活力(表5)。

由表5作pH值與酶活力的關系曲線(圖3)。從圖中可以看出，當pH值升高或降低時酶的活性也隨之變化，堿性磷酸酶的最適pH值是9．84。

2．4 測定不帶電荷極性氨基酸對AP活性的影響

根據試驗方法1．2．6得到表6數據，由處理數據繪制圖4。通過測定相同濃度下不同氨基酸對AP的抑制作用，可見天冬氨酸和半胱酰胺的抑制作用是最大的。

圖2 溫度與平均酶活力的曲線關系

表5 pH值與酶活力的關系

表6 不帶電荷極性氨基酸與酶活性的關系

圖3 酶活力與pH值曲線

圖4 不帶電荷極性氨基酸與酶活力的關系

3 討 論

從AP含量試驗和AP最適溫度、最適pH值試驗中可見已經分離純化到較為純凈的AP。

AP的酶學特性因動物種屬不同而異，本次試驗結果表明，兔肝中AP的最適溫度和最適pH值分別為39℃和9．84。與其他動物來源的AP有一些差異，白蠟蟲(雌成蟲)37℃，8．5［7］;三黃雞(肝)40℃，10．5［8］;黑眉錦蛇(小腸)36 ℃，9．5［9］。

在最適溫度和最適pH條件下，相同濃度的甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺對AP活性的影響試驗中可知，半胱氨酸和天冬酰胺對AP的抑制作用是最大的，甘氨酸的抑制作用相對較小，蘇氨酸的抑制作用最小，其具體的抑制作用表現為:半胱氨酸＞天冬酰胺＞甘氨酸＞蘇氨酸，而絲氨酸則表現有略微的激活作用。一般說來，氨基酸對AP的抑制具有立體異構專一性，只有L-氨基酸才有明顯的抑制作用［10，11］。在測活體系的pH為10的條件下，氨基酸羧基解離帶負電荷，可與酶活性部位附近的帶正電荷的基團可逆結合，而阻礙了底物與酶活性中心的結合，從而抑制了酶活力;也可能由于氨基酸的側鏈基團與酶的結合，導致酶分子構象的變化而影響酶的催化作用［11～13］。在同組試驗小組中研究不同結構的氨基酸對于AP有不同的抑制作用，表明非極性疏水氨基酸中L-Iie的作用最強，而具極性的中性氨基酸作用最大的是L-Cys，而L-His是酸性和堿性氨基酸抑制作用最大的一種［14］。因此，氨基酸對AP抑制作用不僅與其側鏈的理化性質有關，還與特殊的基團有關，如苯環、巰基等。

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